分析产几丁质酶香蕉枯萎病拮抗菌的筛选\鉴定及抑菌作用
枯萎病是导致香蕉植株死亡的土传毁灭性病害。引起香蕉枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，该菌在土壤中营兼性寄生，可在土壤或植株残株中长期存活。病菌通过植株根部伤口或从根毛顶端细胞间侵入植株体内，最终进人维管束。目前还没有一种理想的化学防治药剂。
一些几丁质酶产生菌能抑制病原真菌生长。研究发现这些微生物所产生的几丁质酶能降解真菌细胞壁的主要成分几丁质，从而破坏真菌的细胞壁．使病原菌细胞生长受阻。另外几丁质酶还可破坏病菌菌丝尖端新合成的几丁质，从而使菌丝停止生长、缢缩畸形甚至解体消解。
研究于海南乐东地区枯萎病重发田中选取发病很轻植株，采集其根部土样，分别利用病原菌细胞壁和几丁质作为唯一碳源进行双重筛选。筛选出几丁质酶产生菌．再利用拮抗试验从几丁质酶产生菌中筛选出一株香蕉枯萎病拮抗菌株。进一步研究表明该菌株对香蕉枯萎病镰刀菌具有较好的抑菌效果．并对其抑菌作用进行了研究，研究为该菌的应用研究打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试病原菌为分离自发病植株上的香蕉枯萎病镰刀菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubenserace 4)，经回接确认后保存。
镰刀菌细胞壁固体培养基湿细胞壁100 g，琼脂12g，加蒸馏水至1000mL，调pH值至7.2，高压灭菌。菌的纯化及保存采用NA培养基，病原真菌的培养采用PDA培养基。几丁质培养基的制备参考文献[3]的方法并略有改动。
1.2 方法
1.2.1 香蕉枯萎病镰刀菌细胞壁的制备 在PDA液体培养基中接种病原菌，28℃振荡培养3d，收集菌体并用液氮充分研磨破碎细胞，用无菌蒸馏水反复洗涤去除细胞内容物后离心收集细胞壁，4℃保存备用。
1.2.2 几丁质酶产生茵的双重筛选 取10g土样放入无菌水中充分振荡后静置15min，适当稀释后吸取上清液200μL涂布于镰刀菌细胞壁固体培养基上，30℃恒温培养。待菌长出后，挑取形态特征各异的细菌菌落于NA固体培养基上反复纯化后保存。
将所筛选出的细菌菌株接种于几丁质固体培养基上，30℃恒温培养并随时观察，挑取生长良好、分解圈大且透明、边缘清晰的菌落保存。
1.2.3 拮抗菌的筛选 在PDA平板培养基上接种病原菌，28℃培养2d后，在距平板中心2.5cm处接种筛选出的几丁质酶产生菌．每个培养皿中接种4个菌株。继续于28℃培养并随时观察记录抑菌情况．用对峙法初筛对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的菌株。将拮抗效果较好的菌株连续进行5代对峙培养观察，优选出抑菌效果稳定的菌株于NA固体培养基上划线保存。
1.2.4 菌株的鉴定 在NA培养基上划线接种拮抗菌，30℃培养并连续观察菌落形态。另用接种环取少量菌丝于载玻片上．用生理盐水适当稀释后置光学显微镜下进行形态特征观察。细菌形态特征的观察参照《伯杰细菌鉴定手册》进行。
经优选的拮抗菌株于NA固体培养基上划线出单菌落后送大连宝生物公司进行16SrDNA序列测序。将所得序列提交GenBank数据库并进行BLAST分析比对，选取其中亲缘关系最近的10个菌株的16SrDNA序列，用ClustalX和MEGA3.0软件构建系统进化树。
1.2.5 培养条件对发酵液活性的影响 在其他培养条件不变的情况下，将拮抗菌菌株分别接种于不同pH值和不同温度的几丁质液体培养基中．200r·min-1摇床培养4d，培养液于4℃，8000r·min-1离心5min。上清液用0．22μm微孔滤膜过滤除菌后4℃保存备用。用抑菌圈法测定不同初始pH值和温度对发酵液抑菌活性的影响。pH值分别设定为4、5、6、7、8、9共6个梯度，温度梯度设为25℃、28℃、31℃、34℃，37℃、40℃。每处理重复3次，取其平均值。
在确定了最佳pH和生长温度的情况下．分别以镰刀菌细胞壁和几丁质为唯一碳源制备液体培养基，在2种培养基中接种拮抗菌，200r·min-1摇床培养4d后用抑菌圈法测定不同碳源对发酵液活性的影响。
在50℃左右100mL熔融态的PDA固体培养基中加入1mL病原菌孢子悬浮液，摇匀制成每皿约25mL培养基的平板，在平板中央放置一灭菌牛津杯，杯中加入200μL发酵液，28℃恒温培养。通过测量抑菌圈的大小比较不同处理条件下发酵液的抑菌活性。病原菌孢子悬浮液制备参照文献[5]。
1.2.6 拮抗力发酵液对病原菌菌丝生长的影响
在以病原菌细胞壁为唯一碳源的液体培养基中接种拮抗菌，并按1.2.5中所述抑菌圈法观察发酵液对病原菌生长的影响，挑取抑菌圈边缘的病菌菌丝，于光学显微镜下镜检菌丝形态。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌株的筛选
从镰刀菌细胞壁固体培养基上分离得到形态各异的细菌菌株87株，经纯化后接种几丁质平板．再选出分解圈大而且透明，边缘清晰，生长良好的几丁质酶产生菌10株，然后通过平板对峙实验从这些几丁质酶产生菌中筛选出对香蕉枯萎病菌有抑制作用且抑菌效果稳定的XW-2菌株(图1)。
2.2 X-W-2菌株的分类鉴定
XW-2菌株在NA培养基上菌落呈圆形。灰白色或淡黄色，表面粗糙有皱褶，边缘不整齐，菌落较干燥，菌层较厚，边缘有白色毛边。光学显微镜下细胞呈杆状，大小为0.7μm～0.9μmx2.0μm～3.5μm，革兰氏染色阳性，芽孢卵圆型。XW-2菌株的16SrDNA系统发育分析表明菌株XW一2与Bacillussubtilis G8 (EF491625)， Bacillus subtilis
B3(EF492885)，Bacillus subtilis BIHB(FJ859701)聚于同一分支中，与以上3者相似性超过99％(图2)。结合该菌株的形态特征和分子生物学分析鉴定该菌
株为枯草芽孢杆菌(Baeillus subtilis)。其16S rDNA序列已在GenBank数据库中注册(GenBank aeees-sion GQ305125)。
2.3 不同发酵条件下发酵液活性的研究
用抑菌圈法测定了不同发酵条件下拮抗菌发酵液对病原菌的抑菌活性。实验表明，发酵液活性最高的pH为7～8。初始pH值小于4或大于9时发酵液活性很低。活性产生的最适温度为31～34℃，温度在40℃以上时，
通过比较不同碳源的发酵液对病原菌的抑制作用表明．两者都可抑制病原菌的生长，说明拮抗菌可有效利用细胞壁为唯一碳源，产生抑制病原菌生长的活性物质。但是以几丁质作为碳源的发酵液其抑菌活性较高。
2.4 拮抗菌发酵液对病原菌菌丝的作用
挑取抑菌圈边缘的菌丝在光学显微镜相下观察发现，病原菌菌丝生长受到抑制，菌丝缢缩，破裂、消解、顶端膨大，菌丝体畸形、断裂(图4)，表明XW-2菌株发酵液能有效抑制病原菌菌丝的生长。
3 讨论
枯草芽孢杆菌在自然界广泛存在．能产生具有较强抗逆能力的芽孢，可以耐受各种不良环境，因此是一种理想的生防微生物。关于枯草芽孢杆菌的生防机制，近些年国内外学者进行了大量研究，认为其作用方式多种多样，包括营养和空间位点的竞争、分泌抗菌物质、溶菌作用和促进植物生长等几个方面。枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌活性物质，包括抗生素、细胞壁降解酶及抗菌蛋白等，这种活性物质的多样性可产生不同的防病机制，增强了病害的防治效果。
本实验前期研究中发现在枯萎病流行香蕉田中有数块发病很轻田块。造成这种现象的原因可能是植株根部土壤中存在抑制病原菌生长的拮抗菌。因此．我们采集植株根部土样进行了筛选．而且从这种环境中筛选出来的拮抗菌接种植株后拮抗效果会更稳定。本实验采用镰刀菌细胞壁和几丁质分别作为唯一碳源进行双重筛选培养，提高了筛选的有效性和针对性，对峙实验表明所筛选出的拮抗菌对香蕉枯萎病有较强的抑菌作用，显微观察发现抑菌圈边缘的菌丝顶端膨大、菌丝断裂、消解等现象。推测可能是XW-2拮抗菌分泌的几丁质酶分解了菌丝和细胞壁中的几丁质。造成细胞壁破损，细胞生长受阻，生长畸形等。几丁质酶是一种诱导酶．大多数几丁质及几丁质水解产物均能诱导微生物产生几丁质酶。而且由于底物不同，诱导产生的几丁质酶及作用机理也不同。下一步将对XW-2菌株分泌的活性物质组分进行鉴定并对作用机理做深入的研究。