结缔组织生长因子在单侧肾静脉结扎大鼠肾组织中的表达

　　结缔组织生长因子（connective tissue growthfactor，CTGF）是近年来发现的一种新的致纤维化生长因子口l，CTGF在许多疾病的致纤维化作用中介导了转化生长因子一B （transforming growth factor一13，TGF一13）的功能，机体损伤和纤维化发生时，CTGF表达增高，并且作为TGF一13的下游介质介导了细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和胶原的生成闭。本研究采用单侧肾静脉结扎大鼠模型[31探讨CTGF在不同时间点的动态表达及与 一平滑肌肌动蛋白（仅一SMA）、问质纤维化程度之间的关系。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　（1）实验动物：Wistar大鼠『二级，合格证号：SCXK（豫）2005—0011 50只，雄性，平均体质量（200+20）g，由华北煤炭医学院实验动物中心提供。（2）仪器与试剂：迪瑞H一500尿液干化学分析仪、Bayer一1650全自动生化分析仪、SABC系列免疫组化试剂盒（武汉博士德生物试剂公司），Masson三色染色试剂盒、PASM染色试剂盒（广州俪科贸易有限公司）；小鼠抗大鼠角蛋白（CK）、0l—SMA单克隆抗体、兔抗大鼠CTGF多克隆抗体（武汉博士德生物试剂公司），10％水合氯醛（华北煤炭医学院病理生理学教研室提供），2.5％戊二醛（华北煤炭医学院电镜室提供），10％中性福尔马林『自制：9份磷酸盐缓冲液（PBS）中加1份40％甲醛溶液】。
　　1.2 方法
　　1.2.1 造模与分组50只大鼠自由饮食，适应性喂养7 d，术前随机分为2组：模型组25只，大鼠腹腔注射10％水合氯醛（3 mL／kg）麻醉后仰卧位，无菌操作，经腹玻璃分针分离左肾静脉（左肾位置低，易暴露肾门），4-0号手术缝线结扎；对照组5只，只做分离但不结扎，关腹。所有大鼠术后青霉素腹腔注射预防感染，连续饲养25 d。实验后第5天开始，实验组随机抽取大鼠5只，对照组抽取5只，分别于5、10、15、20、25 d杀检。动物处死之前，测量大鼠的尾动脉血压；留24 h尿，检测尿常规、尿肌酐（Ucr）；眼球取血测血肌酐（Scr）含量。
　　l-2.2 肾脏病理检查（1）大体：取双侧肾脏，肉眼观察颜色、体积、质地并称质量。（2）光镜：双侧肾脏取材，10％中性福尔马林固定，常规脱水包埋，石蜡标本连续切片制成3 m厚切片，分别行HE、Masson染色观察肾组织病理变化情况；采用CI~IIAS真彩色医学图像分析系统对各组Masson染色切片进行半定量分析，对每张切片分别观察10个尽量不含肾小球及大血管的视野 。（3）电镜：1 mm x 1 mm x 1 mm的肾皮质经2.5％戊二醛固定，JErd—IOOCX I1透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞的超微结构、肾间质内是否有肾小管上皮细胞和肌成纤维细胞。
　　1.2.3 免疫组织化学检查（IHC） 使用SABC法 ，采用PBS代替一抗做阴性对照，双盲，CK、仅一SMA和CTGF阳性信号均为浅黄色至深棕色颗粒，阳性部位均为细胞浆，以阳性细胞数及显色强度综合判定阳性。阳性细胞百分数：无细胞染色为0，<25％为1，26％一50％为2，>5O％为3；显色强度：不显色或显色不清为0，浅黄色为1，棕黄色为2，深棕色为3。
　　二项相加：0～1为阴性，2～3为弱阳性，4 5为中度阳性，>5为强阳性[61。每张切片分别选取10个尽量不含肾小球及大血管的视野，采用CI~IIAS真彩色医学图像分析系统对各组免疫组化结果进行积分光密度（integral optieal density，IOD）的测定。
　　1.3 统计学分析采用SPSS 1 1.5统计学软件。计量资料用互虹表示。2组间均数比较用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD—t法。并将CTGF与仅一SMA的积分光密度值进行相关性分析，免疫组化CTGF、 —SMA分别与l~lasson染色胶原蛋白的结果进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 血、尿、血压检查模型组大鼠术后第5天，出现微量镜下血尿和蛋白尿（+），10 d时尿常规恢复正常。模型组术后尿肌酐、血肌酐含量、尾动脉平均动脉血压与相应对照组大鼠相比较，差异无统计学意义（尸>0.05），见表1～3。
　　2.2 组织学检查（1）HE染色：对照组肾脏未见明显的组织学变化。模型组结扎侧。肾脏术后5 d，肾间质弥漫性淤血、水肿伴灶状出血，肾小管扩张，蛋白管型形成；术后15—25 d，可见硬化的肾小球，肾小管萎缩更加明显，肾小管数目减少，肾间质增宽，淋巴细胞和单核巨噬细胞灶状浸润，间质可见大量成纤维细胞，纤维化显着，部分区域有钙化灶形成，见图1。（2）Masson染色：对照组肾脏在血管周围可见到少量蓝色胶原纤维。模型组结扎侧肾脏术后5 d，肾小管周围间质区可见少量丝状胶原纤维；术后l5～20 d，间质蓝色胶原沉积更加明显，互相交错形成片状沉积区；术后25 d，胶原纤维沉积显着，间质区被大量胶原纤维占据，肾小管和肾小球基底膜增厚并有胶原沉积。
　　2.3 电镜观察对照组肾脏未见明显病变。模型组结扎侧肾脏可见受损伤的。肾小管上皮细胞游离到间质表现出间叶细胞的特点，肾小管上皮细胞内线粒体扩张、空泡变性，内质网扩张、囊泡化；术后10 d肾小管上皮细胞变性、脱落，肾间质内可见脱出的肾小管上皮细胞和淋巴及单核细胞；术后15 d和20 d肾间质内均可见肌成纤维细胞和脱出的肾小管上皮细胞。
　　2.4 免疫组织化学（1）Ot—SMA：对照组肾脏肾小管上皮细胞、肾小球及间质细胞中均无阳性信号。
　　模型组结扎侧肾脏术后5 d起部分肾小管上皮细胞为弱阳性表达，随着时间延长肾小管上皮细胞内阳性细胞数逐渐增多，表达强度增强；10 d肾间质内可见仪一SMA表达阳性的细胞，随着时间延长表达增强，25 d时光镜下表现，见图2。连续切片显示肾间质中CK阳性的细胞同时表达0【一SMA。除5 d与10 d 0【一SMA的表达差异无统计学意义（P=0.108）外，其余各时间点之间及与对照组之间比较差异有统计学意义（P<0.001），见表4。（2）CTGF：对照组肾脏肾小管上皮细胞、肾小球及问质细胞中有非常微弱的阳性信号。模型组结扎侧肾脏各时间点均有阳性表达，主要分布于肾小管上皮细胞和增生的肾间质细胞。随着病变的进展，阳性细胞逐渐增多。病变严重时，从近端小管到髓质集合管均有大量表达，甚至萎缩、变性、坏死和脱落于管腔中的上皮细胞中也存在，见图3、4。模型组除5 d时与对照组肾脏CTGF的表达差异无统计学意义（P=0.222）外，其余各时间点之间及与对照组之间比较，差异均有统计学意义（均P<0.001），见表4。
　　2.5 相关性分析（1）CTGF与Ot—SMA蛋白表达：2指标在肾小管间质纤维化（TIF）IOD值分别为8.20+5.26、11.94+5.60，呈正相关（r=0.826，P<0.01）。（2）CTGF蛋白与胶原蛋白表达：CTGF蛋白在1rIF进程中表达的IOD值与Masson染色胶原蛋白表达的面密度值（0.151±0.071）呈正相关（r=0.830，P<0.01）。（3） 一SMA蛋白与胶原蛋白表达：O／。一SMA蛋白在11F进程中表达的IOD值与Masson染色胶原蛋白表达的面密度值（0.151±0.071）呈正相关（r=0.731。P<0.01）。
　　
　　3 讨论
　　
　　肾脏疾病发展到终末期的共同病变过程是TIF。其病理特点是肾小管损伤、肾间质单个核炎细胞浸润、纤维化。但TIF的形成机制仍在不断探索中，本实验利用结扎大鼠单侧肾静脉的方法，成功制作了肾小管问质纤维化动物模型，利用HE、Masson染色及常规透射电镜观察肾小管上皮细胞和肾间质形态学改变。
　　TIF与细胞因子关系密切，其中最为重要的是TGF—B和CTGF。CTGF作为TGF—p的下游介质作用相对单一，它可能仅介导TGF—B的部分生物学效应，即在促进组织器官纤维化方面起重要作用[ 。
　　但是TGF—B作用广泛，除能诱导细胞增生和促进组织纤维化外，尚有抗炎和抗细胞分化等功能，长期完全阻断TGF—B系统必定产生不良后果网。CTGF中和抗体可以阻断TGF—B引起的促纤维化效应，CTGF和TGF一8一样可能是调节肾间质纤维化的重要因子。因此，CTGF是肾纤维化形成过程中的重要介质，但其发挥功能的分子机制仍然不清楚[101。
　　本研究结果显示CTGF在对照组肾小管上皮细胞、肾小球及间质细胞中没有或仅有微量表达。模型组静脉结扎侧肾脏各时间点均有阳性表达，主要分布于肾小管上皮细胞及增生的肾间质细胞。CTGF的表达随着肾问质纤维化的进展逐渐升高，病变严重时，甚至在萎缩、变性、坏死和脱落于管腔中的上皮细胞中也有大量表达。在TIF进程中，CTGF阳性表达量和Masson染色胶原纤维表达呈正相关，说明CTGF始终参与肾小管间质纤维化的演变过程；CTGF和仅一SMA在TIF进程中表达亦呈正相关，表明CTGF可能通过调节上皮细胞转分化来参与纤维化，提示应用一定药物或方法特异性地阻滞CTGF的表达能对肾纤维化疾病的治疗起积极作用。
　　

　　参考文献
　　[1]Rup6rez M，Ruiz—Ortega M，Esteban V，et a1.Angiotensin II In—creases Connective Tissue Growth Factor in the Kidney 『J】。Am JPathol，2003，163（5）：1937—1947.
　　[2] Abdel Wahab N，Mason RM.Connective tissue growth factor andrenal diseases：some answers，more questions .Curr Opin NephrolHypertens，2004，13（1）：53—58.
　　[3] 郭华，邹万忠。肾小管间质纤维化实验动物模型的制备方法[J].临床与实验病理学杂志，2003，19（2）：21 1-212.
　　[4] 邹敏书，余健，刘雪梅，等。氯沙坦对局灶节段性肾小球硬化大鼠转化生长因子一pl及结缔组织生长因子的影响[J].中国药师，2008，11（1）：37—39.
　　[5]张海燕，李幼姬，侯赛云，等。结缔组织生长因子在单侧输尿管梗阻大鼠。肾组织中的表达【J]_中国病理生理杂志，2006，22（3）：427-430.
　　[6] Mizuno S，Matsumoto K，Nakamura T.Hepatoeyte growth factor sup—presses interstitial fibrosis in a mouse model of obstructivenephropathy[J].Kidney lnt，2001，59（4）：1304—1314。
　　[7] Perbal B.CCN proteins：muhifunetional signaling regulators[J].Lancet.2004.363（9402）：62—64.
　　[8] Lee YK，Kim EJ，Lee JE，et a1 Hypoxia Induces Connective TissueGrowth Factor mRNA Expression fJ].J Korean Med Sci，2009，24（Suppl 1）：S176-S182.
　　[9]Gupta S，Clarkson MR，Duggan J.Connective tissue growth factor：potential role in glomerulosclerosis and tubu10interstitial fibrosis[J].Kidney Int，2000，58（4）：1389-1396.
　　[1O]Wahab N，Cox D，Witherden A，et a1.Connective tissue growth factor（CTGF）promotes activated mesangial cell survival via up—regu—lation of mitogen—activated protein kinase phosphatase-1（MKP-1）[J].Biochem J，2007，406（Pt 1）：131 138.