HPLC法测定胸腺五肽含量的方法学研究

　　摘要：目的：药品的含量或效价是评定药品的主要指标之一，设计其测定方法时，应根据药品特性、剂型、处方、鉴别试验和纯度检查综合考虑，在鉴别试验和纯度检查保证专属性和纯度的情况下，应着眼于准确性、稳定性和可重复性选择含量测定方法，并验证方法的可行性。我们根据中国药典和目前文献报道的方法，以胸腺五肽为定量依据．配制各种不同浓度的试液．对其中胸腺五肽含量测定方法进行了方法学研究。方法：运用高效液相色谱仪对TP5的含量进行测定．依据获得的色谱图来建立各试液浓度与峰面积之间的线性关系，并确讧利用其线性关系来测定TP5含量的可行性。在实验中通过对重复性、精密度、稳定性、回收率的测定来保证方法的准确性。结果：应用高效液相色谱法测定TP5的含量，其重复性、精密度、稳定性、回收率、线性范围试验，RSD<2％ ．r>0．999，线性关系良好。结论：高效液相色谱法方法准确、灵敏、专属性强，可作为胸腺五肽的含量测定方法。
　　
　　关键词：高效液相色谱法(HPLC)；胸腺五／Sk(TP5)；含量测定
　　
　　胸腺五肽是从胸腺生成素中提取的由5个氨基酸残基构成的小分子肽。是胸腺生成素Ⅱ的有效部分，位于该单链多肽的第3236位氨基酸序列?(即ArgLysAspValTyr)．1979年Goldstein等 合成了这一氨基酸残基片段，并称之为胸腺五肽(thymopentin，TP5)。实验和临床均显示该胸腺五肽具有与胸腺生成素Ⅱ相同的全部生理功能．即具有双向调节机体免疫系统的功能．能诱导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化3，4]，是一种重要的免疫调节剂。临床上可用于治疗病毒性肝炎，其抗感染、抗肿瘤等疗效显著，因此越来越受到人们的关注。本篇通过对其含量测定的方法进行研究．为制定其质量标准提供依据。
　　
　　1 仪器与试剂
　　
　　Vafian型高效液相色谱仪，UV一1601型紫外可见分光光度计，德国赛多利斯(Sa~ofius)电子分析天平，PHS一25型pH计(上海精密科学仪器有限公司)，胸腺五肽(杭州中肽生化有限公司)，甲醇为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。
　　
　　2 色谱条件
　　
　　色谱柱：OPH RPODS C18(5txm，4．6mmx250mm)；流动相：50mmol-L一磷酸盐缓冲液(以氢氧化钠调节pH在7．0左右)一甲醇(90：10)；流速：1．0mI rain～；柱温：室温；检测波长：275nm；进样最：20lxL。结果表明，胸腺五肽峰与相邻杂质峰的分离度大于1．5．理论板数按胸腺五肽峰计算，应不低于1 200。
　　
　　3 方法学考察
　　
　　3．1 线性关系考察精密称取胸腺五肽对照品5．0rag，置于10mI 容量瓶中，分别称取甲醇374．8rng、乙醇628．1ing、丙酮625．3mg、乙腈50．28mg、二氯甲烷75．30rag、乙酸乙脂625．4mg和四氢呋喃103．1mg，置50mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为1号对照储备液。精密量取1号对照储备液25、10、5、2mL，分别置50m1 量瓶中，加二甲基亚飒稀释至刻度．摇匀，作为2、3、4、5号对照储备液；分别精密量取15号对照储备液1mI ，加二甲基亚砜稀释至10mL．置顶空瓶中．严封。即得l一5号对照液，浓度分别相当于中国药典规定限度的500％ 、250％ 、100％ 、50％ 、20％ 。取 15号对照液201xL，依次进样，记录色谱主峰面积，以主峰面积(Y)对胸腺五肽浓度(X)进行回归分析，得回归方程Y=2036．6X+168．8，(r=0．9991，n=7)。结果线性范围分别为0．3～7．5mgmL，0．5-12．6mgmL，0．5-125mgrnL，0．04-1．0mgmL，0．06-1．5monL，0．5～12．5mgmL，0．08～2．1mgm1 ，表明7种溶剂在上述浓度范围内均具有良好线性关系。
　　
　　3．2 精密度试验准确称取胸腺五肽对照品5．0mg．以流动相配制成浓度为0．5mg／mL的溶液．以20txL／次的进样量连续进样6次。以峰面积计算，测定平均含量为98．4l％，RSD=0．04％，表明精密度较好
　　
　　3. 3 重现性试验对同一批胸腺五肽样品精密称取适量， 分别加0．05molL 磷酸盐缓冲液(pH为6．97)一甲醇(90：10)的流动相配制成供试品溶液，编号为1、2、3、4、5、6。取1、2、3、4、5号溶液20txL进样．测得峰面积值分别为1051．352、1062．804、1048．561、1047．213、1045．882及1048．096， 含量均在96％以』二 其中3号溶液RSD=0．69％ 符合实验要求，方法重现性良好
　　
　　3．4 稳定性试验精密称取胸腺五肽样品适量，加流动相溶解并稀释成每1mL巾含胸腺五肽1．0mg的溶液，作为供试品溶液，取TP5 500mg，精密称定，加二甲基亚砜溶解并稀释至lOmL，置顶空瓶中，严封，以3号对照液为对照，分别于0、3、6、9、12、24h进样20txL进行测定，结果显示：峰面积的RSD=O．56％，可见本品含量测定溶液在24h内稳定性良好。
　　
　　3．5 回收率试验采用加样回收法。分别精密量取胸腺五肽对照品溶液各100~I 放人3个5mL塑料离心管中，精密量取浓度为201xg／mL、401,zg／mL、60txg／mL的样品溶液100tzL，分别加入上述塑料离心管中，混匀后按2项色谱条件进样测定，并计算平均回收率。回收率实验结果显示，3种浓度胸腺五肽的回收率为98％～105％，符合生物样品回收率认可标准85％～1 15％的要求。
　　
　　4 含量测定
　　
　　精密称取胸腺五肽样品5．0mg(批号：20071103)，取两次样，分别加入流动相溶解并稀释，精密量取2O L进样，各进两针：另取已知含量为98．8％ 的胸腺五肽对照品5．0mg(批号：20050917)，同法测定。由色谱图可知，在相同色谱条件下保留时间一致，则可确定为同一物质。用外标一点法计算含量，结果如所示。
　　
　　5 讨论
　　
　　5．1 波长的选择。取胸腺五肽对照品适量．用流动相制成浓度为0．1mgmL 的溶液．在紫外可见分光光度计下进行全波长扫描，胸腺五肽在225 FIII'I波长处存在最大吸收，由于甲醇在220 nm波长左右分离吸收最好，存在溶剂干扰，故选用第二最大吸收波长(275 nm)为检测波长。5．2 胸腺五肽含量测定选用的方法及流动相的选择由于胸腺五肽分子结构中含有酸性和碱性基团，在较低和较高DH下均可能使其部分离子化，使色谱峰对称性变差[9l j。参照胸腺五肽原料药标准含量测定项下色谱条件选择要求：磷酸缓冲盐一甲醇(90：10)为流动相。当流动相的pH值在7．0左右时，胸腺五肽的离子化程度相对较低．且主峰保留时间较为合适。盐浓度对柱效及峰形有一定影响，试验证实，当浓度为50mmolL 时柱效和峰形最佳，继续增大磷酸二氢钾浓度对柱效及峰形无明显改善。
　　
　　5．3 供试品浓度的选择综合考虑实验成本及采用不同浓度的实验结果的效果差异．尽量采用实际试剂的浓度? 。在不同浓度进样时，在测定中进样应从低浓度到高浓度，以避免高浓度对低浓度的影响。