人腺病毒六邻体结构、中和表位构成与腺病毒疫苗研发

　　摘要：背景：人腺病毒是人类多种感染性疾病的病原体。六邻体是腺病毒主要的中和抗原。研究现状：六邻体的中和表位分布在其塔区的五段高变环区，以线性表位为主。研究目的：对腺病毒六邻体中和表位的研究结果将为腺病毒多价疫苗的研发提供参考。
　　
　　关键词：传染病学；人腺病毒；六邻体；抗原性；疫苗
　　
　　0 引言
　　
　　人腺病毒（Human Adenovirus，HAdV）是一群无包膜的双链DNA 病毒，分为1～55个血清型，分别划入A～F 共6 个血清学分组[1]。人腺病毒经呼吸道和消化道传播，引起多种感染，对小儿和免疫缺陷者危害严重。腺病毒感染人体可能引发的疾病包括：急性腺病毒肺炎[2]、急性胃肠炎[3]、眼角膜炎[4]、乳糜泻[5]和急性间质性肾炎[6]等。在儿童急性下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达4.1%[7]。
　　人腺病毒基因组长约36kb，其衣壳（Capsid）呈规则的20 面体结构，直径约80～110nm，没有包膜。腺病毒衣壳共252 个壳粒，包括240 个六邻体（Hexon）、12 个五邻体（PentonBase）及12（或24）根纤突（Fiber），此外还有一些较小的蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2 等[8]。六邻体是形成病毒衣壳20 个体面的主要蛋白，每个六邻体由3 个亚基组成，腺病毒二十面体衣壳的12 个顶点是由五邻体和纤突组成的复合物，其中每个五邻体由5 个亚基构成，每条纤突由3 个亚基构成。纤突以五邻体蛋白为基底由衣壳表面向外伸出，纤突顶端形成头节区（Knob）。壳粒之间存在着若干种分子量较小的蛋白，主要起连接作用以使二十面体的病毒衣壳更为稳定[9]。
　　二十世纪七十年代研发的腺病毒减毒活疫苗曾经在美国军队中接种应用，以预防急性发热，但该疫苗现已不再生产[10]。因此需要寻找更加安全可靠的腺病毒疫苗以预防腺病毒感染。
　　六邻体是腺病毒表面的主要蛋白，也是腺病毒主要的中和抗原[11]，对腺病毒六邻体及其中和表位的研究将为腺病毒疫苗的研发提供重要参考。
　　
　　1 六邻体结构与抗原性
　　
　　六邻体是三个 Hexon 单体（每个单体约900 个氨基酸残基）组成的同源三聚体，有研究者通过X 线衍射法获得了人腺病毒2 型和人腺病毒5 型的六邻体分子确切的三维结构[12,13]，并收录在蛋白质结构数据库（PDB）中[14]。根据上述三维结构测定结果，呈三聚体状态的人腺病毒六邻体分子包含一个六边形的基底区和三角形的塔区。每个单体的基底包含两个区域P1 和P2，P1 和P2 在内部卷曲成8 个稳定的β片层反向平行结构。六邻体的塔区由三个环构成，分别命名为Loop1、Loop2 和Loop4。经单克隆抗体检测不同型的纯化六邻体蛋白表明，六邻体表面的表位（中和表位）存在于这几个环上[15]。其中P1、P2 及Loop4 等区域与三聚体中的其它两个单体的相应区域相互作用，对于维持六邻体的结构稳定性有重要作用。其中P1、P2 及Loop4与来自三聚体中的其它两个单体的相应区域存在相互作用，使得三聚体的结构具有相对的稳定性。Loop1 是最长、最复杂的环，自身经反复折叠并向外突起，可以最大限度的与周围环境相互作用，并与来自另外一个单体的Loop2 相互嵌合在一起构成六邻体塔区的暴露部分[16]。
　　六邻体是腺病毒主要的中和抗原，抗六邻体抗体引发中和反应的能力极强，由六邻体引发的中和抗体具有型别特异性，即由某一型别腺病毒六邻体刺激机体产生的中和抗体主要只对该型别腺病毒具有中和作用，而不能中和其他型别腺病毒的感染性[17]。将人5 型腺病毒的六邻体基因用人2 型的六邻体基因替换后，获得的重组腺病毒表现出的血清型是2 型[18]。有研究认为六邻体上存在的型特异性表位是中和抗体作用的靶点，也是腺病毒对免疫选择压力最敏感的部分，它的特异性很可能是由六邻体蛋白一级结构的氨基酸序列决定的[19]。腺病毒六邻体的型特异性和组特异性表位可能主要位于腺病毒六邻体近N 端和中段[20]。有学者用低温电镜法观察腺病毒同抗腺病毒六邻体中和抗体的结合过程，发现抗六邻体抗体既可以聚集病毒体又可以抑制病毒体的构象改变，最终阻滞腺病毒进入宿主细胞，从而起到中和腺病毒感染力的作用[21]。
　　
　　2 六邻体中和表位
　　
　　抗原表面能够被抗体或者B 细胞受体特异性识别的部分称为B 细胞表位[22]，其中能够和中和抗体结合的表位成为B 细胞表位。
　　腺病毒六邻体的中和表位主要位于其六邻体表面。有学者用免疫学方法将腺病毒的中和表位精确定位到腺病毒六邻体塔区的五个高变环上[15]。其方法是制备一系列抗猿68 型腺病毒六邻体的单克隆抗体，从中筛选出具备中和能力的单克隆抗体，再分别构建腺病毒六邻体塔区五个高变环区的突变株，分别检测各单克隆中和抗体对不同突变株的中和能力，从而确定各单克隆抗体同六邻体的结合位置，并将定位结果映射到用X 射线衍射方法获得的猿68型腺病毒六邻体三维结构模型上，从而明确了腺病毒六邻体中和表位的空间分布和结构。
　　作者课题组在上述研究的基础上，将生物信息学、计算化学和免疫学方法相结合，对人3 型腺病毒六邻体的中和表位进行了一系列研究。
　　本实验室将人3 型腺病毒的中和表位定位到其六邻体塔区的五段高变环区。以哈尔滨地区分离到的人3 型腺病毒毒株Harbin04B 为基础，测定了该毒株的六邻体基因序列，进而通过同源建模的方法，得到了该毒株六邻体完整的三维结构，分析了该蛋白的溶剂表面可及性[23]。结合GenBank 数据库提供的各型腺病毒六邻体蛋白氨基酸序列，用反向进化轨迹方法计算各氨基酸残基的特异性指数，结合三维结构信息，预测位于六邻体塔区上的五段多肽（S1~S5）可能是该病毒B细胞中和表位，并形成两个表位团簇（EC1与EC2）。分别合成这五段多肽，偶联载体成为完全抗原，免疫动物获取抗肽血清，与Harbin04B 株腺病毒进行中和实验，考察抗表位多肽抗体的细胞保护作用。将S1~S5 多肽一起混合偶联载体蛋白，构建多表位抗原，免疫动物获取抗血清，分别对抗单独表位多肽抗体与抗混合表位多肽抗体进行了中和实验，比较对Hela 细胞的保护作用。结果表明，抗五段中和表位混合偶联物刺激机体产生的抗体保护效价接近于抗天然六邻体抗体，远高于抗单独表位肽抗体的保护效价[24]。腺病毒型别众多，为解决多个型别的腺病毒六邻体整群建模问题，我实验室还发展了一种基于进化树的快速建模方法[25]，给后续研究提供了便利。
　　中和表位在空间结构上可能是构象性的或者线性的。曾经有报道将腺病毒六邻体的三聚体用热变性方法解聚，结果得到的单体蛋白不再具有免疫原性，提示腺病毒六邻体的中和表位可能是构象性的。但是更多的研究结果倾向于认为腺病毒六邻体的中和表位是线性的。对于猿68 型腺病毒[15]和人3 型腺病毒[24]而言，分别合成中和表位的抗原肽，得到的肽都可以独立地同抗腺病毒中和抗体结合，提示腺病毒中和抗体是能够识别其表面的线性表位的。我实验室还曾进行了人3 型腺病毒六邻体塔区的亚克隆[26]，构建基因重组表达载体[27]，用Ni-NTA 层析纯化重组蛋白，免疫家兔制备血清，检验该蛋白的免疫原性和反应原性[28]。结果发现该重组蛋白具有良好的抗原性，仍保留了3 型腺病毒的特异性。由于塔区只是六邻体的一部分，单独表达的六邻体塔区不可能拥有同天然六邻体一致的空间构象，但是单独表达的塔区仍然具有同天然六邻体接近的抗原性和特异性，所以该结果进一步说明了人腺病毒六邻体的中和表位在空间结构上是线性的，而非构象性的。
　　
　　3 腺病毒疫苗研发
　　
　　传统的人腺病毒减毒活疫苗已不再生产，但是随着基因工程技术的不断进步，新型腺病毒疫苗正在研发之中，包括有复制能力型[29]和复制缺陷型[30]腺病毒活疫苗。但是这些腺病毒候选疫苗都存在一个共同的难题，它们都是针对于腺病毒的某一个型别设计的，只能用于针对性的预防相应型别的感染。而腺病毒的型别多达55 种，如何构建抗腺病毒的多价疫苗，始终是困扰研究者的难题。
　　基于对腺病毒六邻体中和表位的认识，腺病毒的中和抗原表位集中在六邻体塔区的五个高变环区，而且其中和表位的空间结构以线性为主，没有复杂的构象性表位。这为腺病毒多价疫苗的研发提供了若干可能的思路，其一是构建一个串联多肽，将多个型别的腺病毒中和表位连成一个整体，另一个思路是分别合成多种中和表位多肽，再连接至共同的载体，构建多价疫苗。
　　作者所在课题组长期从事基于六邻体的基因工程重组腺病毒疫苗研发。对六邻体塔区和基底区进行亚克隆和表达，验证了纯化的重组蛋白的抗原性和免疫原性[26-28]。用同源建模的方法构建了人3 型腺病毒的六邻体结构模型[23]，结合进化轨迹法筛选并验证了腺病毒六邻体上的五个中和表位[24]。这些工作为腺病毒重组疫苗的开发奠定了良好的理论与实验基础。
　　
　　4 结语
　　
　　120 人腺病毒血清型众多，引发多种感染性疾病，对儿童和免疫力低下者威胁严重。传统腺病毒疫苗已经停产，急需研发新型腺病毒疫苗。六邻体是人腺病毒的主要中和抗原，其中和表位分布于六邻体塔区的五个高变环区，在空间结构上以线性表位为主。腺病毒六邻体中和表位的研究为新型多价腺病毒疫苗的研发提供了重要启示。

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