低剂量苯并(a)芘暴露对小鼠肝和肺microRNAs表达谱的影响

　　摘要：[目的] 运用微阵列芯片技术研究长期低剂量暴露于苯并(a)芘[B(a)P]后小鼠肝组织和肺组织的miRNAs 表达谱差异，并对差异表达miRNAs 进行靶基因预测，探讨miRNAs 与外源性致癌物健康效应的关系。 [方法] 18-22g 小鼠随机分为对照组和染毒组，每组20 只，雌雄各半。经口给予小鼠5μg/kg B(a)P，每周2 次，持续8 周，对照组同时给予同等剂量的橄榄油溶剂。染毒结束后继续饲养8 周，取肝脏组织和肺脏组织，Trizol 法分别提取组织总RNA，miRNAs 芯片杂交，检测小鼠肝脏组织和肺脏组织的miRNAs 表达谱，并对暴露组和对照组的miRNAs 进行差异表达分析。运用miRanda 和TargetScan 软件预测miRNAs 可能调控的靶基因。 [结果] 对照组的肝、肺组织的信号强度分析结果显示，绝大部分的miRNAs表达丰度较低，少数miRNAs 表达丰度较高较高，其中miR-122, miR-762, miR-22, miR-194,miR-494, miR-192 只在肝组织中具有较高表达丰度，miR-23a, miR-145, miR-126-3p,miR-143, miR-16, miR-125b-5p, miR-103 只在肺组织中具有较高表达丰度。与对照组相比，暴露组的miRNAs 表达谱发生明显改变。肝组织中共有21 个miRNAs 表达异常，其中10 个miRNAs 上调，11 个miRNAs 下调，最大差异表达为5.65 倍。肺组织中共有24 个miRNAs 表达异常，其中19 个miRNAs 上调，5 个miRNAs 下调，而最大差异表达8.76 倍。B(a)P 暴露引起的差异表达在肝组织和肺组织中的表现方式具有很大的不同，只有miR-720 和miR-699同时在肝组织和肺组织明显下调，绝大部分miRNAs 只在肝组织中或者肺组织中有明显改变，有4 个miRNAs 甚至在肺组织中明显上调而在肝组织中明显下调。对在肝、肺组织中均显著异常表达的miR-720 进行信息学分析，筛选出的靶基因中涉及信号转导因子、免疫调节因子、癌症相关基因等。[结论]长期低剂量B(a)P 暴露可以引起小鼠肝、肺组织的miRNAs 表达产生特异性改变，可能在B(a)P 致机体健康效应过程中起着重要作用。
　　
　　关键词：microRNAs；芯片；表达谱；苯并(a)芘；环境致癌物
　　
　　0 引言
　　
　　苯并(a)芘[B(a)P]是致癌性最强的多环芳烃类化合物之一，存在于许多环境污染物中，动物实验和流行病学显示它可诱发多种癌症，并可对血液、肝脏、中枢神经及内分泌系统造成一定损害。鉴于B(a)P 是日常生活或工业生产过程中产生的副产物，因此它对于人类健康构成严重威胁。
　　MicroRNAs（miRNAs）是长约22 个核苷酸的内源性非编码RNA 分子，在真核生物的基础生物化学和代谢过程中起着非常重要的作用[1,2]，为近年来分子生物学研究的热点之一。最近的许多研究表明miRNAs 可能调控癌症的发生、发展、侵袭和转移[3-5]，miRNAs 表达谱对癌症的分类、诊断和预后检测可能具有重要意义[6]，但miRNAs 表达是否可对环境化学致癌物暴露产生特异性反应目前仍不明确，此方面的报道，尤其是体内实验的报道极少。因此，本次研究以小鼠为研究对象，观察低浓度长期暴露于B(a)P 后miRNAs 表达谱的改变状况，为探讨miRNAs 在B(a)P 健康损害过程中的作用以及机制提供依据。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 动物染毒18-22g ICR 清洁级小鼠购于青龙山动物实验中心。适应5 天后随机分为两组，每组20只，雌雄各半。暴露组灌胃给予5μg/kg B(a)P，一周两次，共染毒8 周，对照组同时给予溶剂橄榄油。染毒结束后继续饲养8 周。
　　
　　1.2 样本准备及 RNA 提取动物放血处死，取肺脏和肝脏组织称重后立即置入液氮，随后转入-80℃冰箱保存备用。Trizol 法提取组织总RNA，琼脂糖检测完成性，吸光度A260/280 测定浓度及纯度。
　　
　　1.3 芯片杂交与数据分析合成 miRNAs 寡核苷酸探针，Affymetrix 公司miRNA 芯片杂交，Affymetrix GeneChipScanner 3000 进行荧光强度扫描，Affymetrix GeneChip Command ConsoleTM 1.1 进行数据采集（北京博奥公司）。对暴露组和对照组miRNAs 表达进行比较，取比值≥2 或≤2 的为具有显著性意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 miRNAs 在小鼠肺、肝组织的信号强度及表达分析比较对不同组织 miRNAs 的信号强度分析结果显示，绝大部分miRNAs 的表达信号较低，极少数miRNAs 的表达信号较强（图1）。对对照组表达信号分析结果显示15 个miRNAs在正常肝组织中具有较强表达(>1000)，16 个miRNAs 在正常肺组织中具有较强表达(>1000)，其中miR-122, miR-762, miR-22, miR-194, miR-494, miR-192 只在肝中具有较强表达，miR-23a, miR-145, miR-126-3p, miR-143, miR-16, miR-125b-5p, miR-103 只在肺中具有较强表达。
　　
　　2.2 miRNAs 在B(a)P 暴露组和对照组小鼠肝、肺组织的差异表达分析比较与对照组相比，B(a)P 暴露组小鼠肝组织中具有21 个miRNAs 表达异常，肺组织中具有24 个miRNAs 表达异常。B(a)P 暴露引起的差异表达在肝组织和肺组织中的表现方式具有很大的不同，在肝组织中引起上调和下调的miRNAs 数目和水平均相当，其中10 个miRNAs 上调，11 个miRNAs 下调，最大上调和下调差异表达均为5-6 倍左右，而在肺组织中主要引起miRNAs 上调，其中19 个miRNAs 上调，5 个miRNAs 下调，而最大上调水平为8-9 倍，而最大下调水平为3 倍左右，肺组织较肝组织对B(a)P 暴露可能较敏感。
　　对暴露B(a)P 后差异表达基因汇总分析发现，只有2 个miRNAs 同时在肺组织和肝组织下调：miR-720 和miR-699。绝大部分miRNAs 在肝组织和肺组织中的改变并不一致，14 个miRNAs 在肝组织中有明显改变而在肺组织中没有发生改变，18 个miRNAs 在肺组织中有明显改变而在肝组织中没有发生改变。甚至部分miRNAs 在肺组织中明显上调而在肝组织中明显下调：miR-466j，miR-466f，miR-466f-5p，miR-574-5p。
　　
　　2.3 差异表达 microRNAs 的靶基因调控分析鉴于 miR-720 在肺组织和肝组织中均呈现上调，我们对其进一步进行了可能的靶基因分析。鉴于不同软件的分析原理和结果不完全一致，单一软件的分析结果特异性不够，我们采用分别用两个软件miRanda 以及TargetScan 进行分析，对两个软件分析出来的相同的基因按照排序相加后，取前50 个最有可能的靶基因进行分析。结果显示miR-720 可能调控的靶蛋白中包括转录因子与激酶家族，如钙调蛋白结合转录因子、锌指蛋白、磷酸肌醇磷酸激酶、酪蛋白激酶、泛素连接酶；免疫相关蛋白，如免疫球蛋白超家族、清道夫受体、肿瘤坏死因子受体等；癌症相关蛋白：癌基因、抑瘤素受体。
　　
　　3 讨论
　　
　　miRNAs 的发现不仅为肿瘤的研究开拓了全新的视野，同时也有证据表明miRNAs 在机体对环境有害化学物的反应中也可能扮演重要的角色[7,8]。Schembri 等[9]对吸烟和非吸烟者支气管上皮细胞的miRNAs 表达谱进行检测，发现差异表达miRNAs 主要表现为在吸烟者中下调。进一步对差异表达最强的miR-218 进行分析，发现香烟烟气冷凝物可引起细胞中miR-218 表达明显降低，而其靶基因表达水平也随之改变。但也有研究显示miRNAs 表达对二恶英暴露缺乏反应[10]。目前关于miRNAs 表达和环境化学物的关系的研究极少。
　　本次实验从动物整体暴露水平对B(a)P 低剂量长期接触与miRNAs 表达谱的关系进行了研究。对肝、肺组织的miRNAs 表达水平分析结果显示miRNAs 表达具有一定的组织特异性，这与已报道的研究结论相吻合。对暴露组和对照组小鼠肝、肺组织的差异表达分析显示长期低剂量B(a)P 暴露可引起明显的miRNAs 表达水平改变。值得注意的是，这些变化异常的miRNAs 信号值普遍较低，说明它们处于低丰度表达。此外，只在暴露组检测到而在对照组检测不到，或者只在对照组检测到而在暴露组检测不到的miRNAs 表达同样处于非常低的表达水平。说明低丰度表达的miRNAs 可能对外源性化学物质更敏感，在调控生物体功能过程中起到更主要的作用。在肝、肺组织中产生差异表达的miRNAs 绝大部分均不相同，说明不同组织对外源性化学物质的反应过程中具有独特的miRNAs 表达谱变化，这些相同化学物产生不同反应的miRNAs 可能在不同组织中具有不同的作用。对miR-720 的靶基因预测结果表明miR-720 可能通过调节这些蛋白参与调控B(a)P 介导的细胞生物学功能和损伤过程，如细胞增殖、代谢、凋亡、免疫反应及恶性转化等，但这些需要进一步的大量的功能研究实验对其进行验证。
　　通过对miRNAs 差异表达谱分析可以更好的了解与外源性化学物质毒性或疾病相关的miRNAs 的不同反应及其调控机制，并为进一步筛选与外源性化学物质毒性组织特异性相关的监测或评价的敏感标志物以及可以改变其毒性作用的药物靶点提供依据。

　　
　　[参考文献] (References)
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　　[2] ZHANG B H, WANG Q L, PAN X P. MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants [J]. J CellPhysiol, 2007, 210:279～289.
　　[3] ZHANG B H, PAN X P, COBB G P, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors [J]. Dev Biol,2007, 302:1～12.
　　[4] TAKAMIZAWA J, KONISHI H, YANAGISAWA K, et al. Reduced expression of the let～7 microRNAs inhuman lung cancers in association with shortened postoperative survival [J]. Cancer Res, 2004, 64: 3753～3756.
　　[5] MA L, TERUYA-FELDSTEIN J, WEINBERG R A. Tumour invasion and metastasis initiated bymicroRNA-10b in breast cancer [J]. Nature, 2007, 449:682～688.
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　　[8] POGRIBNY I P, TRYNDYAK V P, BOYKO A, et al. Induction of microRNAome deregulation in rat liver bylong-term tamoxifen exposure [J]. Mutat Res, 2007, 619:30～37.