离体人精囊平滑肌收缩活动与a1受体阻滞剂间相互作用

　　摘要：目的 采用离体组织实验技术与分子生物学技术研究a1 受体亚型及其阻滞剂对男性射精功能影响的作用机制, 探讨坦索罗辛所致射精障碍(EjD)显著高发的原因。方法 取手术切除的人精囊54 例,采用JH-2 张力换能器和BL-420E+生物信号采集处理系统观察记录a1 受体阻滞剂坦索罗辛、哌唑嗪、特拉唑嗪和萘哌地尔对外源性去甲肾上腺素（NA）刺激产生的精囊和输精管平滑肌收缩活动的抑制作用。结果 a1 受体阻滞剂对100μMNA刺激诱发的精囊肌肌条节律性收缩的抑制呈量效依赖性， 其作用强度顺序为坦索罗辛>哌唑嗪>特拉唑嗪≥萘哌地尔。结论 坦索罗辛对NA 诱发的人离体精囊平滑肌收缩活动具有强大抑制作用，显著强于其它药物。
　　
　　关键词：a1 受体阻滞剂；射精障碍；精囊
　　
　　0 引言
　　
　　目前学界对?1受体阻滞剂治疗相关的射精功能障碍（EjD）的发病机制的认识尚不统一，特别是对选择性?1A受体阻滞剂坦索罗辛和西洛多辛所致EjD显著高发现象的机制研究极具争议。
　　本研究采用离体组织实验测试坦索罗辛、萘哌地尔、特拉唑嗪、哌唑嗪等四种不同选择性?1受体阻滞剂对去甲肾上腺素（NA）诱发的离体人精囊平滑肌条收缩的抑制作用并对比，探讨不同亚型选择性?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌收缩功能的作用差异及其可能机制，从而进一步揭示?1受体阻滞剂所导致EjD现象。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 研究对象离体组织机能实验材料精囊选取2007年5月至2008年12月在四川大学华西医院泌尿外科行膀胱、前列腺恶性肿瘤根治性切除术中的精囊标本54例，患者年龄为28－73岁，平均54.3岁，术前未服用过?1受体阻滞剂和5?还原酶抑制剂等可能干扰精囊平滑肌功能的药物。所取组织大体正常且无明显病变累及，严格按照解剖结构取材标记后，立即置于盛(95％O2+5％CO2)混合气体饱和的冷Krebs缓冲液的20ml容器中，再将后者放于4℃冰盒内迅速送至机能实验室，所有精囊平滑肌功能实验均在术后6-12小时内完成。
　　
　　1.2. 主要仪器和试剂
　　1.2.1 试剂1受体阻滞剂：哌唑嗪 ( prazosin ) ,特拉唑嗪( terazosin ) ,萘派地尔（naftopidil）,坦索罗辛（tamsulosin）,去甲肾上腺素（noradrenaline）;其中?1 受体阻滞剂均先溶于含有二甲基甲酰胺(DMF)和乙酸（Acetic acid）（v/v，3:1）的溶液配制成1.0×10-2mol/L 高浓度溶液，然后以蒸馏水逐次稀释至实验所需各浓度测试液。去甲肾上腺素则以蒸馏水为溶剂配制而成。
　　Krebs缓冲液：每日用双蒸水新鲜配制，PH7.4。其成分为：氯化钠（NaCl）118 mmol/L，氯化钾（KCl）4.7mmol/L, 氯化钙（CaCl2）1.2 mmol/L，磷酸二氢钾（KH2PO4 ）1.2 mmol/L，硫酸镁（MgSO4）1.2 mmol/L，碳酸氢纳（NaHCO3）25 mmol/L，葡萄糖（glucose）11 mmol/L。
　　1.2.2 仪器张力换能器（型号:JH-2B）,生理记录分析系统（型号: BL420 E+）,超级恒温水浴(型号：CS-501),离体组织恒温灌流系统(型号：HV-4)医用氧气（95％O2 + 5％CO2）,微量注射器（10μl、50μl、100μl）。
　　
　　2 实验方法
　　
　　自冰盒取出精囊标本后立即置于通以（95％O2+5％CO2，流量2L/min)混合气体饱和的冷Krebs缓冲液中，仔细去除精囊表面附着的血管脂肪筋膜等结缔组织，将其囊壁沿长轴环行修剪成形平滑肌条（长10mm,宽5mm）标本4－8段。
　　将精囊肌条垂直悬挂于离体组织恒温灌流系统（HV-4）里盛有10mlKrebs缓冲液的浴管中，两端分别以棉线连接JH-2张力换能器和浴管底部的固定钩，Krebs液中持续通入上述混合气体，保持温度37士0.5℃。JH-2张力换能器导入BL-420E+生物信号采集处理系统(模数转换器)，在计算机上观察和记录平滑肌等长收缩活动（收缩幅度、频率及持续时间）。
　　用累计浓度法加入NA（1μM→600μM，均为浴管内终浓度）刺激，每次观察记录约5－15min（以每次达到最大收缩为准），构建NA刺激平滑肌收缩的量效曲线，以最佳浓度NA刺激获得精囊平滑肌稳定节律收缩后，肌条分Ⅰ坦索罗辛、Ⅱ萘哌地尔、Ⅲ特拉唑嗪、Ⅳ哌唑嗪4个实验组，采用累积加药法分别向浴管内加入上述药物（10-9M→10-4M），观察药物对平滑肌收缩活动的抑制作用并构建量效曲线；另设同期对照组，同样方法加入含溶媒的Krebs液替代药液。
　　另取精囊肌条分A坦索罗辛、B哌唑嗪、C特拉唑嗪、D萘哌地尔4个实验组，分别在浴管内加入坦索罗辛（3nM、10nM、30nM），哌唑嗪（10nM、30nM、100nM），特拉唑嗪（30nM、100nM、300nM），萘哌地尔（100nM、300nM、1000nM）20-30min后用累计浓度法加入NA液（1μM→600μM）刺激平滑肌收缩，观察药物对平滑肌收缩抑制作用，每一浓度药物取得相应量效曲线观察完药物的干预作用后，用Krebs液反复冲洗肌条，待其张力恢复正常后60min，再进行下一浓度药物测试。
　　
　　3 结果
　　
　　3.1 1受体阻滞剂对精囊平滑肌收缩的抑制作用?1受体受体阻滞剂坦索罗辛、哌唑嗪、特拉唑嗪（10-9M→10-4M）、萘哌地尔（10-9M→10-5M）对100μM NA刺激诱发的节律性收缩的抑制呈量效依赖性，其IC50值分别为1.47×10-7M、5.57×10-7M、3.26×10-6M，而萘哌地尔在所测浓度内不能达到50％的抑制作用。
　　NA（1－600μM）刺激诱发的精囊平滑肌收缩呈量效依赖性，其pD2 值为4.46±0.03。连续4 次累计增加浓度的NA 刺激获得的量效曲线具有良好可重复性。坦索罗辛（3nM、10nM、30nM）、哌唑嗪（10nM、30nM、100nM）、特拉唑嗪（30nM、100nM、300nM）和萘哌地尔（100nM、300nM、1000nM）对NA 诱发的肌条收缩呈竞争性抑制，使量效曲线右移（图2,3）。?1受体受体阻滞剂抑制强度顺序为坦索罗辛>哌唑嗪>特拉唑嗪≥萘哌地尔。坦索罗辛的抑制作用最强，当其浓度为10nM 时的抑制作用显著强于30nM 哌唑嗪，300nM 特拉唑嗪和1000nM 萘哌地尔对精囊平滑肌收缩活动的抑制作用。
　　
　　4 讨论
　　
　　本实验中测试了临床常用的四种?1受体阻滞剂坦索罗辛、哌唑嗪、特拉唑嗪和萘哌地尔对外源性NA刺激诱发的人离体精囊平滑肌收缩活动的药理作用，同时观察了它们对单一浓度NA诱发的精囊平滑肌条稳定节律性收缩和累计增加浓度NA刺激诱发的精囊平滑肌收缩的抑制作用。研究结果表明在离体组织实验条件下这些?1受体阻滞剂与NA呈竞争性抑制关系，与以前文献报道相一致。实验中坦索罗辛显示出最强的竞争性抑制作用，明显强于其它?1受体阻滞剂。
　　在Hisasue等[1]和Hellstrom等[2]的临床试验中已经证实?1受体阻滞剂治疗相关的EjD是前向射精量的减少，而非逆行射精。Hisasue等[1]在试验中还发现服用坦索罗辛的六个受试者中不但精液量减少，而且其中五个人的精液里未检出精子，果糖含量也显著降低。由于精液中果糖成分来源于精囊分泌，而精子则依赖输精管转运，故这些研究发现均提示?1受体阻滞剂抑制男性生殖道尤其是精囊和输精管的平滑肌收缩活动从而导致了EjD。这一观点部分得到了动物实验结果的支持，例如：在大鼠动物模型中，Kim等[3]发现坦索罗辛对下腹神经电刺激诱发的精囊和输精管收缩反应的抑制作用显著强于哌唑嗪和特拉唑嗪；Giuliano等[4]也观察到坦索罗辛对神经电刺激诱发的大鼠精囊和膀胱颈腔内压力增加反应的抑制作用显著强于阿呋唑嗪；Tambaro等[5]则在离体组织实验中证实坦索罗辛对外源性NA或电刺激诱发的大鼠附睾段输精管平滑肌收缩反应的抑制作用显著强于阿呋唑嗪。
　　虽然上述动物实验在一定程度上说明不同?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌药理作用存在显著差异，然而因其实验的局限性使得研究结果缺乏说服力。首先，?1受体各亚型在大鼠与人体组织器官的分布不同，大鼠的输精管以?1A受体为主且优势介导其收缩活动，而人输精管的纵行肌以?1A受体为主且优势介导收缩活动，环行肌则由?1L受体亚型优势介导[6]。其次，在大鼠实验中研究者对?1受体阻滞剂检测的剂量范围不够充分[7]。在实际临床应用中，不同的?1受体阻滞剂的药物用量是不同的，例如：特拉唑嗪和阿呋唑嗪的常规用量几乎是坦索罗辛的13倍，而萘哌地尔则是坦索罗辛的100倍以上。这导致大鼠实验中观察到的不同?1受体阻滞剂作用差异难以确定到底是药物本身药理特性导致的还是由于药物剂量不同导致的。此外，人与大鼠的输精管收缩模式不尽相同，前者活动模式远较后者的复杂[8]，而大鼠体内实验结果也不能排除是由于药物的组织分布差异导致了其对生殖道平滑肌作用的不同，从而导致EjD发病率的显著差异的可能。
　　为进一步说明动物实验结果，在本实验中我们直接观察和测试了不同?1受体阻滞剂对外源性NA刺激诱发的人离体精囊平滑肌收缩活动的抑制作用差异。实验中，坦索罗辛与其它药物的测试浓度达到了几十倍，甚至上百倍的差距，充分涵盖了药物临床用量的不同。实验结果显示低浓度的坦索罗辛对精囊平滑肌活动的有强大抑制作用，显著强于其它药物，这说明它们之间药物作用强度的差异是药理特性的差异，是质的不同，而不是仅仅由于量的差异，这也说明药物在体内的分布差异可能不是导致这种EjD发病率显著差异的关键因素。
　　迄今不同?1受体阻滞剂导致显著差异性EjD发病率的潜在原因还不清楚，但主要推测为外周阻断假说和中枢阻断假说。外周阻断机制认为?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌上分布的?1受体的阻断导致了精囊和输精管的收缩活动受抑，从而产生EjD。由于男性生殖道平滑肌中α1A受体占主导地位且介导了包括输精管、精囊、前列腺等组织器官在内的平滑肌收缩，因此外周阻断机制将选择性α1A受体阻滞剂坦索罗辛与非选择性α1受体阻滞剂所致EjD发生率的差异归因于选择性α1A受体阻滞剂对α1A受体亚型的高选择性[9]。虽然外周阻断假说在一定程度上可以解释?1受体阻滞剂所致EjD发生原因，但却无法满意解释不同选择性?1受体阻滞剂所致EjD发生率的显著差异现象，这是因为无论选择性或非选择性?1受体阻滞剂都能阻断?1A受体亚型，而且临床非选择性?1受体阻滞剂的用量常常大于坦索罗辛，有研究表明在临床常用剂量下选择性α1A受体阻滞剂坦索罗辛与非选择性?1受体阻滞剂对?1A受体亚型的结合率是相似的[10]，这意味着在理论上所有的?1受体阻滞剂都可以对精囊和输精管等器官的平滑肌收缩活动产生相似的抑制作用，这却与临床现象相矛盾。另一方面，中枢阻断机制认为这种EjD发生率差异的出现在于射精中枢调节机制参与。有研究表明在临床药物用量水平上坦索罗辛能与多巴胺受体（D2）和5-羟色胺受体（5-HT1A）结合[11]。Giuliano等[12]在大鼠实验模型研究中发现用5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT行侧脑室注射后诱发的球海绵体肌收缩能被静脉给药的坦索罗辛所抑制，而阿呋唑嗪则不能，从而推测坦索罗辛能通过血脑屏障作用于中枢神经系统（CNS）的?1受体。正常情况下，CNS的?1受体激动后促使多巴胺和5-羟色胺释放，两者再与D2、D3和5-HT1A受体结合而对男性射精功能发挥重要调节作用。阻断CNS相应受体则可干扰这一调节，从而出现EjD。然而中枢阻断机制同样存在不少疑问，包括坦索罗辛并不能轻易越过血脑屏障；中枢受体阻断后对性功能甚至全身机能的影响必然是多方面的，为什么仅出现EjD高发？这都是中枢机制难以说明的。
　　在本实验中，我们观察比较了临床常用的四种?1受体阻滞剂对外源性NA刺激产生的离体人精囊收缩活动的抑制作用差异，研究结果表明在去除CNS影响下，坦索罗辛对精囊平滑肌收缩的抑制作用显著强于其它药物，坦索罗辛治疗相关的EjD高发现象可以是由于其对生殖道平滑肌的独特药理作用所导致，不同?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌的抑制作用差异可以发生在外周组织水平上，这支持外周阻断假说。此外，在实验中我们检测了四种各具不同亚型选择性?1受体阻滞剂（坦索罗辛：选择性?1A/D受体阻滞剂；哌唑嗪：非选择性?1受体阻滞剂；特拉唑嗪：非选择性?1受体阻滞剂；萘哌地尔：选择性?1D/A受体阻滞剂）以证实是否是?1受体阻滞剂对α1A受体亚型的选择性高低导致了其对生殖道平滑肌收缩抑制作用的强弱这一推测，实验结果表明对精囊平滑肌的抑制作用强度顺序是坦索罗辛>哌唑嗪>特拉唑嗪≥萘哌地尔，这显然与四种?1受体阻滞剂对α1A受体亚型选择性的高低顺序矛盾，因此不同?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌的作用差异可能并不来源于它们对生殖道局部器官组织分布的α1A受体阻滞作用，其它的外周作用机制值得进一步研究。
　　本实验从外周机制角度研究探讨了坦索罗辛导致EjD显著高发的原因及其对男性射精功能的作用机制，构建了坦索罗辛等?1受体阻滞剂对生殖道平滑肌收缩抑制作用的清晰量效曲线，这为?1受体阻滞剂在早泄、痛性射精、慢性前列腺炎等男科治疗领域的新应用提供了理论线索。早泄是男性最常见的性功能障碍，长期以来其治疗效果差，药物疗效不确切，困扰了全世界至少20％以上的成年男性。男性生殖道平滑肌被视为早泄治疗的重要靶点，?1受体阻滞剂因其对平滑肌收缩的抑制作用也一直被认为很有希望用于治疗早泄[13]。非选择性?受体阻滞剂酚妥拉明曾被用于早泄治疗，但严重的心血管系统副作用使其在临床应用中受限。
　　目前坦索罗辛在临床实践中已证实具备公认的良好安全性和耐受性，本研究结果表明坦索罗辛对生殖道平滑肌有强大抑制作用，这提示以坦索罗辛为代表的选择性?1A受体阻滞剂很可能在临床早泄治疗中取得突破，有必要进行相关的临床试验研究。

　　
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