C反应蛋白基因多态性与川崎病及其冠脉损伤的关系

　　[摘要]【目的】研究人类c反应蛋白(CRP)基因+1059G／C、一757T／C多态性(SNPS)与川崎病(KD)及其冠状动脉损害(CAI。)的关系。【方法】通过基因测序对30名KD患儿和60名对照组儿童分别进行CRP基因+1059G／C、一757T／C位点DNA序列测定。【结果】①KD组CRP基因+1059G／C多态性位点的GG、GC基因型分布频率和G、C等位基因频率、一757T／C多态性住点的TT、TC、CC基因型分布频率和T、C等位基因频率与正常对照组比较均无显著性差异(P均>O．05)。②合并冠脉损伤者与无冠脉损伤组基因型分布频率和等位基因频率比较均无显著性差异(P>o．05)。【结论]CRP基因+1059G／C、一757T／c基因多态性与川崎病及其冠状动脉损害的发生均无明显关联性。
　　
　　[关键词]C反应蛋白质； 多态现象(遗传学)； 粘膜皮肤淋巴结综合征
　　
　　川崎病(Kawasaki Disease，KD)是一种原因不明的急性发热出疹惟儿童免疫性血管炎综合征。冠状动脉病变为其最严重和最常见的并发症，目前已取代风湿热成为儿童期后天获得性心脏病的首位原因[1]，并认为与青壮年心源性猝死和成人缺血性心脏病的发生有关心]，故探讨KD及其冠脉损害(CAL)的发病机制具有重要的临床意义。本研究选择人类C反应蛋白(CRP)作为候选基因并对其2个多态性位点进行测序分析，旨在探讨CRP基因多态性与儿童KD易感性及其CAL并发症的关系，为寻找其分子遗传学发病机制提供参考。
　　
　　
　　1 资料和方法
　　
　　1. 1研究对象　　
　　选择30例2006年1月至2008年12月在本院住院治疗的汉族KD患儿，均符合d,)UII崎病诊断标准[3J，男19例，女11例，年龄6个月至7岁，平均年龄(2．4±1．6)岁，均行血清免疫球蛋白、补体C3、肝功能、血红细胞沉降率(血沉)、CRP、血常规检测，并经心脏彩色多普勒检查，其中合并CAI。者17例?。同时选择60例中同湖南省健康体检的汉族儿童供对照研究，均排除感染性疾病、心血管疾病、风湿性疾病等，并排除既往川崎病吏。男30例，女30例，年龄7个月至9岁，平均年龄(3．8±1．9)岁。
　　
　　1．2 实验方法　　
　　①标本收集及血液基因组DNA提取。入院d。在患儿父母知情同意下，用含抗凝剂EnTAK2采血管取静脉血2 mL，并立即移入冻存管置--80℃保存，半年内采用PureGene DNA提取试剂盒，按照说明提取血液基因组DNA，置一20℃冰箱备用。②引物设计与合成。参照文献设计引物，引物由北京英骏生物技术有限公司合成。序列见表1。③PCR反应扩增。PCR反应体系：总体积为20 pL，包括10×反应缓冲液2弘L，镁离子终浓度为2．0mmol／L，四种脱氧核糖核苷酸终浓度为0．2 retool／L，上下游引物各10 t比mol，KOD DNA聚合酶0．4U和模板DNA 50 ng。PCR反应条件：94℃预变性5min，接着94℃变性20s，68℃退火和延伸3 min，共32个循环，最后68℃延伸5 rain。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳进行监测。④基因突变位点的确认：将PCR扩增产物进行切胶纯化，送中美泰和生物技术(北京)有限公司以美国ABI公司生产的3730xl DNA测序仪协作进行DNA序列测定．测得的序列与Genbank中报道的基因序列用软件中的对核苷酸序列作比较。+1059位点测序引物为5，-1vrA CAG TGGGTG GGT CTG AAA TA T盯髓3；-757位点测序引物为5。TTG C,CA]ACT TGA GGA GCA AGGAGA AGG AG-3。引物由北京英骏生物技术有限公司合成。
　　　1．3 统计学分析　　
　　运用SPSSl3．0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差(z土s)表示，基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，研究对象基因型与Hardyweinberg平衡的符合程度、组内2'n 2，O 2弓n 240 2SOI．AACATOToOOAjTTTOTGCTOlCACCAOATo产　GATTA,ACACCATCT及各组间基因型及等位基因频率比较采用f检验或Fisher确切概率法。
　　
　　2 结果
　　
　　受试对象皆完成实验，资料均有效，全部纳入结果分析。入院5 d内收集川崎病组临床资料，心脏彩色多普勒检查追踪至病程第3周内显示冠状动脉损害者(包括动脉狭窄、动脉扩张、动脉瘤)17例，占56．7％。
　　
　　2．1 PCR扩增结果
　　按上述PCR反应体系及条件扩增，CRP基因+1059G／C位点基因引物扩增出长度为515bp的片段，一757T／C位点基因引物扩增出长度为510 bp的片段。
　　
　　2．2 CRP基因+1059、一757位点基因型测序结果见。
　　
　　2．3 Hardyweinberg吻合度检测
　　CRP基因+1059G／C、--757T／C位点的基因型频率在JlI崎病组、正常对照组分布经Hardy-weinberg吻合度检测分另0为0．6050(X2=0．0411)；0．8144(X2=0．7865)。基因型分布均符合HardyWeinberg遗传平衡定律，样本具有群体代表性。
　　
　　2．4各组基因型和等位基因分布比较
　　在KD组和对照组发现CRP+1059G／C基因位点GG、GC基因型分布频率、及G、C等位基因频率差异无显著性(P均>o．05)；CRP一757T／C基因位点TT、TC、CC基因型分布频率、及T、C等位基因频率差异无显著性(P均>O．05)。KD组中合并冠脉损伤组与无冠脉损伤组CRP基因+1059G／C、一757T／C位点各基因型分布频率比较差异均无显著性，各等位基因频率比较差异亦均无显著性(P均>0．05)。
　　
　　3 讨论
　　
　　目前多数学者认为KD是在遗传因素背景下，微牛物毒素以超抗原介导机制所引起的免疫性血管炎综合征。炎症细胞因子引起内皮细胞凋亡增加可能是造成KD血管损害的机制之一L5j。在外界环境及遗传因素的相瓦作用下，不同个体在KD的易患性／抵抗性、并发症上表现出差别。
　　CRP是炎性免疫性疾病急性时相反应标志物，正常情况下以微量形式存在于健康人的血清中，半衰期短，合理治疗后3～7 d迅速降至正常，可以反映病情的严莺程度及转归。KD患儿中CRP水平在急性期明显升高。与IL一6、IL-I的基因多态性对CRP水平的调控相关，亦与CRP基因多态性对CRP水平的调控有关，CRP基因变异对机体血清CRP水平可发挥35％～50％的作用【6J。人类CRP基因位于人染色体组1q21到1q23之间，全长约6．8kb，包括2个外显子，中间由一个内含子隔开。第一个外显子编码一条前导肽及CRP的前两个氨基酸，第二个外显子编码剩余的204个氨基酸。两个外显子之间是一个内含子，富含GT重复序列。CRP基因表达的调控主要发生在转录水平，已经分别在其启动子区、内含子区、第二外显子区、一3非翻译区、一3侧翼序列发现了9种单核苷酸多态性(SNP)与CRP水平表达相关。
　　rsl800947(+1059G／C)位于CRP基因的第二外显子上[7]，这种多态性没有改变所编码的氨基酸(CTG-CTC，LeuLeu)，只是通过关联其他未被发现的CRP功能突变或附近的基因来影响CRP表达的水平。一757T／C单核苷酸多态性位于基因启动子中，而启动子是转录开始时RNA聚合酶与模板DNA分子结合的部位，对转录起到调节作用，决定基因的基础表达。CRP基因多态性与冠心病、脑血栓等卒中性疾病可能相关。研究发现中国汉族成人中存在CRP的+1059G／C基因多态性，GG基因型的高敏CRP水平显著高于(GC+CC)基因型【81；冠状动脉狭窄程度与+1059G／C的基因多态性相关∽j。一757T>C多态性变异通过影响转录过程，也有可能通过影响启动子的活性，从而影响基础血清CRP水平[9]。国外报道有CRP+1444 C／T多态性位点中T等位基因频率与KD相关联[20|，但其他位点多态性与KD关联性尚无报道。
　　本研究应用基因测序技术对30例川崎病患儿和60例正常对照儿童进行CRP基因多态性分析，结果发现在中国湖南汉族儿童中存在CRP的+1059G／C、一757T／C两个位点基因突变，提示该基因的多态性在KD儿童中多见。在KD和对照组中+1059G／C基因型频率表达GG>GC型，均未发现CC型，与成人报道有所不同，GG基因型表达在KD组更明显，但差异无统计学意义，且CRP+1059G／C等位基因频率G、C在两组间差异均无显著性，相似的结果发生在一757T／C基因多态性基因型频率和等位基因频率统计学分析中。提示CRP摹因七述位点基因多态性可能与KD发生的易感性无相关性，也可能与种族差异或观察例数等因素有关。结果还发现在KD合并冠脉损伤组CRP+1059G／C的GC基因型频率较无冠脉损伤组高，C等位基因频率亦较无冠脉损伤组高．但两组间差异均无统计学意义。同样的结果发生在CRP一757T／C的TT基因型频率及T等位基因，差异亦均无湿著性。提示CRP基因上述位点多态性与川崎病冠状动脉损害发生的易感性无相关性，也可能与本组病例数较少有关。

　　
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