单管半巢式PCR法检测梅毒螺旋体的分析探讨论

【摘要】目的 探讨单管半巢式PCR法检测梅毒螺旋体的适用性；方法 对我院2009年6月至2010年6月收治的梅毒患者89例应用单管半巢式PCR进行检测分析；同时相应地用ELISA法进行检测。结果 TP-ELISA方法检出率为91.0l％(81/89)，单管半巢式 PCR方法检出率为31.46％(28/89)； TP-ELlSA法和单管半巢式PCR法检测的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)；结论 单管半巢式PCR法检测血液样本梅毒螺旋体还需要做进一步研究探讨。

【关键词】单管半巢式PCR；ELISA；梅毒螺旋体

Single pipe half nested PCR method to detect syphilis

helicoid analysis is discussed

[Abstract] objective single pipe half nested PCR method to detect syphilis helicoid applicability, Methods to June 2009-2010 June 89 cases of syphilis patients were used single pipe half nested PCR detection analysis, Correspondingly by ELISA test. Results TP - ELISA method for detection 91.0l% (81/89), single/half nested PCR detection method for 31.46% (28/89), TP - ELlSA method and single pipe half nested PCR detection method is, the difference was statistically significant (P<0.05, Conclusions single pipe half nested PCR method to detect the blood samples treponema pallidum still need further study.

[key word] single pipe half nested PCR, ELISA, Syphilis helicoid

目前应用于无偿献血者梅毒抗体筛选的主要方法有甲苯胺红血清不需加热试验(toluidine red unheated serum reagin，TRUST)及酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assav，ELISA)方法，但其对一期梅毒、伴艾滋病梅毒、神经梅毒等敏感性低，不能区分母体梅毒与胎传梅毒，不能判断传染性；梅毒螺旋体(treponema pallidum，TP)还不能人工培养，兔感染实验(rabbit infection test，RIT)虽然是检测TP最可靠最灵敏的方法，然则适用性不高，而PCR方法在此情况下显示其独特的优越性^［1］。现对我院2009年6月至2010年收治的梅毒患者89例应用半巢式PCR筛查血液的实验结果报导如下。

1资料与方法

1.1一般资料

本组资料共计89例，均为2009年6月至2010年我院收治的梅毒患者。男57例，女32例，年龄20～48岁，病程6天～6个月。其中硬下疳51例，扁平湿疣13例，梅毒性斑丘疹25例。硬下疳和扁平湿疣患者均在暗视野显微镜下查见苍白螺旋体；梅毒性斑丘疹患者均经TPHA试验确诊证实。

1.2 取材方法

患者皮损拭净后轻刮或挤压至出渗液，棉拭于拭取渗液作为PCR检测梅毒螺旋体标本。同时取血清作为RPR检测标本。

1.3 试剂

试剂PCR试剂北京天根公司购买，引物由上海生物工程公司合成；DNA Mini Kit为Qiagen公司产品；TP抗体EIJSA试剂(双抗原夹心法)：英科新创(厦门)科技有限公司，批号：2007077507。

1.4实验方法

1.4.1 PCR引物设汁及合成

根据已发表的 TP polA基因序列(GenBank 11)U57757)，设计了4条引物，每条引物均包含编码1～2个半胱氨酸(C)。P1：CGTCTGGTCGATCTGCAAATGAGTG(相应氨基酸为TSGRCANEC),P2:CACAGTGCTCAAAA ACGCC 11CCACG(相应氨基酸为RAGVFEHCA),P3:TGCGCGTGTCGAA1TGTGGTC(相应氨基酸为CACANGVV),P4:TGCA CATGTACACTGAGTI1GACTCGG(相应氨基酸为TESVQCTCA)。

1.4.2 DNA模板制备

TP Nichols标准株用煮沸法提取模板；血清/全血标本用DNA Mini Kit提取模板。

1.4.3 常规及半巢式polA PCR

常规polA PCR以P3、P2为引物扩增，巢式polA PCR以Pl、P2为外引物，P3、P4为内引物扩增一反应体系均为50μl，包括5μl 10 x PCR缓冲液(20 mMol/L Tris-CI、pH 8.4：200mM KC1；100 mM (NH4)S04；15 mM MgCl₂),1μldN FPmixture(10mM),引物1．25μl(25μlmol/L)，Taqplus酶5u，DNA模板5μl(内引物扩增时用第1次扩增产物2μl为模板)。单管半巢式则在单管巢式基础上设计P1引物，P2引物与第1轮扩增共用。

1.4.4 血液标本中TP的检测

用TP-ELISA检测阳性血液标本均用常规polA PCR与单管半巢式polA PCR检测。

2结果

2.1 常规及半巢式polA 扩增结果

用常规PCR扩增TP Nichols poLA得到377hp的DNA片段，半巢式PCR扩增外引物得到59BP的DNA片段，内引物扩增得到174bp的DNA片段。但是在扩增血液标本时，只有半巢式PCR内引物得到174bp的DNA片段，常规PCR和半巢式PCR外引物未出现条带。

2.2 血液标本中 TP-EL1SA的检测结果

拟诊为梅毒的89份血液标本结果见表1。TP-ELISA方法检出率为91.0l％(81/89)，半巢式polA PCR方法检出率为31.46％(28／89) ，TP-ELISA方法和半巢式polA PCR方法检测血液标本的结果相比差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 TP-ELlSA方法与半巢式PCR检测结果比较

+           27      1             28

-                 54      7             61

合计        61      8             89

3 讨论

梅毒构成以隐性及一、二期为主。ELISA法采用双抗原夹心法检测血清标本中的梅毒特异性IgM和IgG抗体，对早期和晚期梅毒均有较高的检出率。其灵敏性和特异性基本接近梅毒螺旋体明胶凝集试验方法，且操作简便，通过酶标仪直接读取数据，克服肉眼难以判断结果的缺点，可直接输入计算机储存处理，减少人为操作和判断失误，尤其适合血站大批量样品的筛查处理，但其对一期梅毒、伴艾滋病梅毒、神经梅毒等敏感性低，而且不能区分母体梅毒与胎传梅毒，不能判断传染性^［2］。

随着基因工程技术的迅速发展和TP全基因序列的解析，多种PCR方法被用于TP的检测。TP polA编码的半胱氨酸多达24个，占多聚酶氨基酸总数的2．4％(绝大多数的微生物只有1～2个，占0．1％)，有4个特殊的插入子。有学者曾以前述P3P2为引物进行常规PCR，证实了该引物的高度特异性^［3］。

此外，当前检测TP的PCR用杂交等方法来提高敏感性，即使如此，对TP含量极低、存在难以去除的Taq酶抑制因子的全血/血清或脑脊液等标本敏感性仍低，为提高检测全血/血清、CSF等标本中TP的敏感性及特异性，本实验采用半巢式PCR，检测临床血清/全血标本，半巢式polA PCR与TP-ELISA方法的结果差异有统计学意义。半巢式polA PCR的敏感性远高于常规polAPCR。但是PCR对血液标本检出率低与国外MartinAA 等报道一致，与国内相关学者报道也一致^［4］。我们分析认为可能有以下四点原因：① 梅毒螺旋体是一种革兰氏阴性原核细菌，在人体内血液循环停留时问短，不是病毒样可以将自己的DNA整合到宿主基因组中，适用于早期梅毒的检测；②血液标本的采集后的保存条件及从血液标本提取TD基因组的质量，对实验的成败也至关重要；③血清固定，即梅毒经治疗后，有少数患者血清反应不转阴，依然是不可忽视的原因；④PCR反应试剂的质量尤其是Taq酶的质量，选取质量好的Taq酶对实验成败有着及其重要的影响。

综上所述，应用半巢式PCR方法检测血液标本中梅毒螺旋体虽然理论上是可行的，但在实际应用过程中对样本要求高且成本高，同时，会受到其他多种因素影响。因此，是否适用于血液样本梅毒螺旋体检测还需要做进一步研究。

参考文献

[1]曾铁兵，吴移喋，黄澍杰，等．半巢式PCR扩增梅毒螺旋体 A及其临床应用的研究．中国皮肤性病学杂志．2004，18(2)：74～76

[2]居来提，田晓波，古海尔，等．新疆3172冽梅毒流行病学分析．中国麻风皮肤病杂志．2(03，16(1)：23～25

[3]胡小兵，李俊杰，赵艳杰，等 TRUST与 TP—EusA法对无偿献血者血清梅毒检测对比分析．中国误诊学杂志．2005，5(5)：885～886

[4]Martin AA，Liu H，Sutton MY，et al Arnplification ofthe DNA polymerase1 gene of Treponema paltidum from whole blood of persons with syphilis．Diana Microbiol Infect Dis．2001 Aug；40(4)