CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在脑型疟疾发生中的作用研究
31. 引 言脑型疟疾，简称脑疟（cerebral malaria, CM）是恶性疟原虫感染引起的一种严重综合症，主要发生于儿童和无免疫力的成人，可导致显著致死性和长期后遗症[1]。虫血症不能得到有效控制和随后寄生虫对脑微血管系统的黏附是CM 发生的主要原因[2]。而前炎性细胞因子又是寄生虫粘附脑微血管的关键[3]。
前炎性和抗炎性应答的平衡是决定疟疾感染结局的关键[4, 5]，二者的失衡是导致严重疟疾的主要原因[6]，其中调节性T 细胞在维持前炎性和抗炎性应答的平衡中起着重要的作用[6]。
CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞（regulatory T cells, Tregs）是天然存在的具有独特调节功能的T 细胞亚群[7]，实验研究发现，Tregs 通过表面膜分子与其它细胞直接接触或分泌抑制性细胞因子IL-10 和TGF-β 等方式发挥免疫抑制功能[8]，抑制体内CD4+与CD8+T 细胞等多种免疫细胞的活化、增殖和效应功能[9]。
伯氏疟原虫ANKA（Plasmodium berghei ANKA, P.bANKA）感染小鼠实验脑疟（experimental cerebral malaria, ECM）与人类CM 有许多共同特征，因此是研究人类CM 的最佳动物模型[10-12]。本实验以P.bANKA 分别感染C57BL/6 和BALB/c 小鼠建立CM 易感和抵抗小鼠模型，动态观察Tregs 数量与前炎性和抗炎性细胞因子的相互关系，以期探讨Tregs在CM 发生和发展过程中的作用地位。
2. 材料与方法
2.1 疟原虫及实验动物感染
6-8 周龄，雌性C57BL/6 和BALB/c 小鼠（中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK 京2004-0001）经腹腔注射1×106P.b ANKA( 日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠)寄生的红细胞（pRBC）。感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。每日观察感染小鼠神经体征：脑疟定义标准为出现以下临床症状的一种：麻痹，抽搐，昏迷，共济失调，来回翻滚，偏瘫。
2.2 脾细胞培养
分别于感染前和感染后第3d、5d、8d，常规无菌取出小鼠脾脏，用0.17mol/L NH4C1裂解红细胞。以含10 %胎牛血清（FCS）的RPMI 1640 调整脾细胞终浓度为1×107/ml，于24 孔培养板中，每孔加入500μl 脾细胞悬液培养48h 后，收集培养上清，﹣80℃保存，待IFN-γ 和IL-10 检测。
2.3 细胞因子的检测
用双抗体夹心ELISA 试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ 与IL-10 的分泌水平。酶标仪测定450nm 处OD 值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro4.3.1Ls 软件分析，计算细胞因子含量（pg/ml）。
2.4 流式细胞术检测脾细胞悬液中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs 的数量
每份样品，即新鲜制备的1×107/ml 脾细胞悬液0.1ml，用FITC-conjugated anti-mouseCD4/L3T4 (GK1.5) 、APC-conjugated anti-mouse CD25/IL-2 receptor alpha (PC61) 和PE-conjugated anti-Foxp3 (clone FJK16s, eBioscience) 进行三色分析，另设阴性对照管。预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入新鲜制备的1×107/ml 脾细胞悬液0.1ml，再加入抗CD4-FITC 和抗CD25-APC mAb 表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-PE mAb胞内染色，含1%胎牛血清（FCS）的PBS 洗涤两次后悬浮于500μl PBS 中，流式细胞仪(BectonDickinson, USA)检测，以前向和侧向散射角确定淋巴细胞群，CD4+T 细胞画门，分析计算CD4+CD25+Foxp3+ Tregs 的绝对数量。
2.5 统计学处理
应用SPSS11.5 统计学分析软件，单因素方差分析比较各组均值的显著性差异，p<0.05为差异显著（结果为3 次结果的均值）。
3. 结 果
3.1 2 种小鼠感染后不同时间的原虫血症水平及生存率
如所示，C57BL/6 小鼠对CM 的发生高度易感，于感染后8-11 天死于麻痹、抽搐、昏迷等脑疟症状，虫血症水平为15-20%；而BALB/c 小鼠对CM 相对抵抗，于感染后3-4周死于贫血和过度虫血症，虫血症水平为70-80%。
3.2 2 种小鼠感染后不同时间脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的数量
如所示，2 种小鼠感染后3 天Tregs 绝对数均出现有意义升高（p<0.05 和p<0.01）并达峰值，随后Tregs 数量逐渐下降，于感染后第8 天C57BL/6 小鼠Tregs 数量下降显著并明显低于正常对照组（p<0.05）。不同时间点C57BL/6 小鼠的Tregs 数量均低于BALB/c 小鼠（p<0.05 和p<0.01）。
3.3 2 种小鼠感染后不同时间脾细胞培养上清中IFN-γ 水平
如所示，易感型C57BL/6 小鼠脾细胞培养上清IFN-γ 水平于感染后5 天达峰值（p<0.01），是同天感染BALB/c 小鼠的2 倍，随后缓慢下降但仍明显高于正常水平（p<0.01）。相比，抵抗型BALB/c 小鼠脾细胞上清IFN-γ 水平仅于感染后5 天出现有意义升高（p<0.01），随后恢复至正常水平。
3.4 2 种小鼠感染后不同时间脾细胞培养上清中IL-10 水平
如所示，易感鼠C57BL/6 脾细胞培养上清IL-10 水平于感染后5 天达峰值（p<0.01），随后迅速下降至正常水平。相比，抵抗型BALB/c 小鼠脾细胞上清IL-10 水平于感染后5 天达峰值，随后缓慢下降但仍高于正常水平（p<0.01），是同天感染C57BL/6 小鼠的2 倍。
4. 结论
Tregs 作为一个具有独立功能的T 细胞亚群, 在维持免疫调节网络中具有举足轻重的作用，尤其在自身免疫病和感染性疾病的免疫应答调节中发挥不可替代的作用[13]。相关研究发现前炎性和抗炎性应答之间建立适当的平衡对于控制严重疟疾造成的病理损伤是至关重要的，而Tregs 对于这种平衡能否维持是个关键[6]。
CM 是由大量前炎性细胞因子上调脑内皮细胞粘附分子表达继而导致寄生虫黏附引起的一种严重综合症[3]。Tregs 在P.bANKA 感染过程中抑制了寄生虫诱导的T 细胞应答[8]，然而早期炎症应答对控制寄生虫的增殖及其重要[14]。本实验结果发现P.bANKA 感染的C57BL/6 小鼠于感染后8-11 天死于CM，虫血症仅为15-20%；而BALB/c 小鼠于感染后3-4w死于贫血和重度虫血症。另外，2 种感染小鼠脾Tregs 数量于感染后第3 天达峰值，随后逐渐下降，但抵抗鼠的Tregs 数量始终高于易感鼠。我们的结果证明Tregs 的活化和增殖与CM的感染过程和结局密切相关。C57BL/6 小鼠感染早期由于Tregs 数量较低，Th1 应答过强，分泌大量前炎症细胞因子导致内皮活化，寄生虫（单核细胞）黏附，阻塞脑血管，导致其后的循环缺血缺氧，出现麻痹，抽搐，昏迷等脑疟症状，最终死亡。相比，BALB/c 小鼠感染早期Tregs 数量较高，能有效的控制过强的炎症反应，虽然抑制了CM 的发生，但由于疟原虫的大量增殖，最终死于贫血和过度虫血症。
另外本实验发现，作为Th1 型免疫应答的特征性分子IFN-γ，在P.bANKA 感染的C57BL/6 小鼠体内持续升高，于感染后5 天达峰值，感染后8 天仍维持较高水平，是同天感染的BALB/c 小鼠的2 倍。相比而言，BALB/c 小鼠的IFN-γ 水平较低，虽然于感染后5 天达峰值，但随后迅速下降至正常水平。然而抗炎性细胞因子IL-10 水平在P.bANKA 感染的C57BL/6 小鼠体内仅于感染后5 天出现低水平的一过性增高。相比，BALB/c 小鼠的IL-10水平持续升高，是同天感染C57BL/6 小鼠的2 倍。由此表明严重疟疾感染时维持前炎性和抗炎性应答的平衡是防止CM 发生的关键。
前期研究表明约氏疟原虫感染过程中，Tregs 通过分泌IL-10 抑制Th1 应答。本实验结果显示P.bANKA感染过程中Tregs 数量的变化与IL-10 水平不一致，可能的原因是P.bANKA感染过程中IL-10 的主要来源是适应性Tregs，即CD4+CD25- Foxp3- CD127- Tr1 细胞[15]。
综上所述，虫体血症的出现和随后过强的前炎症应答对脑疟发生是必需的。本研究表明疟疾感染期间保护性免疫和病理损伤之间的平衡取决于前炎性应答与抗炎性应答的巧妙平衡，而上述因素均随着Tregs 数量的动态变化而改变，因此Tregs 通过修饰前炎性与抗炎性应答而影响CM 感染过程和结局。
参考文献
[1] Randall LM, Amante FH, McSweeney KA, et al. Common strategies to prevent and modulate experimentalcerebral malaria in mouse strains with different susceptibilities [J]. Infect Immun, 2008, 76(7): 3312-3320.
[2] Amante FH, Stanley AC, Randall LM, et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis ofexperimental cerebral malaria [J]. Am J Pathol, 2007, 171(2): 548-559.
[3] Weiser S, Miu J, Ball HJ, et al. Interferon-gamma synergises with tumour necrosis factor andlymphotoxin-alpha to enhance the mRNA and protein expression of adhesion molecules in mouse brainendothelial cells [J]. Cytokine, 2007, 37(1): 84-91.
[4] Couper KN, Blount DG and Riley EM. IL-10: the master regulator of immunity to infection [J]. J Immunol,2008, 180(9): 5771–5777.
[5] Finney OC, Nwakanma D, Conway DJ, et al. Homeostatic regulation of T effector to Treg ratios in an areaof seasonal malaria transmission [J]. Eur J Immunol, 2009, 39(5): 1288-1300.
[6] Walther M, Jeffries D, Finney OC, et al. Distinct roles for FOXP3+ and FOXP3-CD4+ T cells in regulatingcellular immunity to uncomplicated and severe Plasmodium falciparum malaria [J]. PLoS Pathog, 2009, 5(4):e1000364.
[7] Torcia MG, Santarlasci V, Cosmi L, et al. Functional deficit of T regulatory cells in Fulani, an ethnic groupwith low susceptibility to Plasmodium falciparum malaria [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(2):646-651..
[8] Vigário AM, Gorgette O, Dujardin HC, et al. Regulatory CD4+CD25+Foxp3