64排CT增强在肝癌边缘强化特征探究
原发性肝细胞癌（primary hepatocellular carcinoma,PHCC）是肝脏常见的恶性肿瘤，临床侵袭性极强，预后很差，病死率逐年增高，是影响我国人民健康的重大疾病。近年来，由于对原发性肝癌病理认识的加深，对PHCC的生物学行为、疗效、预后提出了更高的要求。关于PHCC螺旋CT肝动脉、门静脉（简称门脉）双期增强表现特征及其在诊断方面的应用价值已有大量文献报道，但有关PHCC边缘强化特征的组织病理学基础及与PHCC生物学行为之间的关系，文献较少报道_l引。本研究拟对比研究PHCC边缘的强化特征及其与组织病理学改变之间的相关性，以期更深入了解PHCC的生物学行为，为临床选择治疗方案并预测其预后提供更有意义的信息。1 资料与方法
1.1 研究对象
搜集64例经手术病理证实的PHCC患者，男44例，女20例，年龄34-76岁，平均47岁；其中巨块型肝癌4l例，结节型肝癌23例（其中小肝癌8例），6例病灶位于肝左叶，其余则位于肝右叶，病灶最大者12 cm×15 cm,最小1.1 em×2.1 cm.临床表现：肝区疼痛、消瘦乏力、肝脏触及肿块、部分患者出现黄疸。AFP≥500 ng/mL 54例，HBsAg（+）60例，肝硬化48例。作CT检查前未行任何抗癌治疗，CT检查符合本研究要求，并达到预期增强效果。CT检查后行手术切除治疗，均经病理证实为肝细胞癌。
1.2 扫描方法
全部病例采用GE公司64层VCT机（Light-speed VCT），层厚5 mm,CT机电压120 kV,160 mA,矩阵512×5l2,螺距1:1.患者空腹，于肘前静脉留置20G的静脉套管针，扫描前10 min口服清水500mL,扫描时加用腹带，扫描过程嘱患者平静呼吸。先行全肝CT平扫，初步确定肿瘤范围、大小，扫描范围自膈顶至肝下缘。用双筒高压注射器以5 mL/S速度注入对比剂100 mL欧乃派克（300 mg~mL）行螺旋CT肝双期扫并随即用生理盐水20 mL以同样速率注入。扫描时间：肝动脉期20~30 S,门静脉期50-60 s,其中18例延迟至平衡期120 S扫描。适当地调整窗宽（250~300 Hu）和窗位（45~80Hu），以保证对PHCC包膜的清晰显示。
1.3 CT扫描图像观察
对PHCC边缘特征描述按如下标准进行：边缘清晰有假包膜型（I型），平扫肿瘤边缘均呈围绕肿块的低密度影，显示清晰、完整。边缘清晰无假包膜型（Ⅱ型），平扫、肝动脉期及门静脉期肿瘤边界清晰但无假包膜形成。边缘模糊型（Ⅲ型），全部平扫、肝动脉期、门静脉期甚至平衡期肿瘤与正常肝组织无明确分界线，边缘形态不规则。混合型（Ⅳ），具有以上3种类型表现。平扫、肝动脉期及门静脉期肿瘤边界清晰或模糊，部分可见假包膜形成。
1.4 病理学观察
①大体标本观察：手术切除下的新鲜肝脏未经任何固定处理尽量按术前CT扫描的对应层面和CT扫描层厚逐层将标本切开，肉眼观察癌灶剖面肿瘤包膜、肿块边缘与非癌变肝组织交界是否清楚，肝内有无子灶。
②取材：在肝内病灶最大层面处的四边周缘部分，取癌组织与非癌变肝组织不同交界区组织块3块（5 mm×10 mm×5 mm）。根据术前CT的观察，同一肿瘤可以全部边缘组织块切片都属于同一类边缘形态，亦可以根据不同种类的边缘形态在不同的边缘位置取材。
③染色与观察：64例手术标本10%福尔马林固定，石蜡包埋，分别做HE和免疫组化染色，由病理科医生重点观察生长方式、有无包膜、边缘有无癌细胞浸润、边缘（或包膜内）阳性血管的多少等变化。免疫组化采用二步法，载玻片用防脱胶处理，切片厚3 m,组织切片经二甲苯脱蜡、脱苯、水化后，置于pH 6.0枸橼酸缓冲液中用高压锅进行抗原修复3 min,冷却后用PBS缓冲液冲洗3次，分别滴加既用型一抗HapParl、CD34及CD10（购自福建省福州生物制剂有限公司），置于4℃冰箱内过夜，PBS洗涤后滴加二抗（购自福建省福州生物制剂有限公司）37 oC孵育30 min,然后用DAB溶液显色10 min,蒸馏水冲洗、苏木素复染、封片。阴性对照用PBS液代替一抗，HapParl、CD10阳性对照用正常肝组织，CD34阳性自身对照。
④ 阳性范围计分：0~5% 为0分，6% 一25% 为1分，26% ~50%为2分，5l% 一75%为3分，>75%为4分；阳性着色计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分（根据阳性着色部位，排除假阳性）。两项结果相加<2分为阴性（0），2~3分为阳性“+”,4~5分为中度阳性“++”,6~7分为强阳性“+++”.微血管密度（mierovessel density,MVD）阳性结果判定：按照Weidner_3 报道的方法，先在400倍视野中，随机选择5个新生血管最密集区，即所谓“热点”,然后再在100倍光镜视野下采集图像。每例选取血管密度最大的、不同区域的5个视野图像，然后在计算机病理图像分析系统中计算阳性血管数目，取5个图像的MVD值的平均数作为该病例的MVD值。每张切片随机观察5个中倍（×200）视野，每个视野计数100个细胞，计算每个视野中阳性细胞数的平均百分比作为该切片阳性细胞百分比进行计分。微血管包括染成棕色的单个内皮细胞，或内皮细胞簇至成管腔，甚至较大的血管，只要和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就作为一个血管计数；即使是同一个血管的“头”和“尾”正巧在同一个切面上，也作为2个微血管计数；但管腔大于8个红细胞大小，有较厚肌层及硬化区的血管均不计数。MVD>30,肿瘤边缘血管较丰富。
2 结果
2.1 CT肿瘤边缘征象分型及增强扫描结果
边缘清晰有包膜型（I型）15例，肿瘤直径2.5~ 15 cm,平均7.2 cm,平扫肿瘤边缘均呈围绕肿块的低密度影，显示清晰。6例肝动脉期肿瘤边缘低密度影，门静脉期包膜环形增强，其外围借以环状低密度影与正常肝组织间分开；7例动脉期、门静脉期为低密度，延迟至平衡期假包膜环形增强；1例肝动脉期假包膜强化，门静脉呈等或低密度。1例肝动脉期及门静脉环形增强。
边缘清晰无包膜型（Ⅱ型）26例，肿瘤直径4.8~ 10 cm,平均6.5 cm,平扫、肝动脉期及门静脉期肿瘤边界清晰无包膜。肝动脉期，17例肿瘤边缘见不规则斑点、条状或环形明显增强血管影，其中9例可见肿瘤边缘部分肿瘤组织强化，密度较平扫及肝动脉期增高，8例门脉期呈低密度。3例动脉期肿瘤边缘呈低密度，而门脉期呈高密度。6例双期均未见明显强化，表现为低密度。全部病例门静脉期肿块周围肝实质明显增强，边界更清晰。14例边缘模糊型（Ⅲ型）20例，肿瘤直径1.1~13cm,平均9.0 cm,全部平扫、肝动脉期、门静脉期肿瘤与正常肝组织分界不清，边缘不规则。5例肝动脉期肿瘤边缘未见增强血管影；门静脉期肿瘤边缘组织不规则强化，与部分正常增强的肝组织混在一起呈混杂密度或岛状 13例动脉期、门静脉期均未见明显强化。2例动脉期瘤体边缘呈低密度，门脉期未见明确肿瘤边缘。18例可见肝内转移灶子灶，12例为多发，6例为单发。2例门静脉主干及分支内瘤栓形成，1例侵及胆囊，1例肿瘤内见少量出血。4例肝门区、腹主动脉旁可见多个增大淋巴结影，部分融合成团。
混合型（Ⅳ）3例，肿瘤直径4.1-8.5 cm,平均5.5 em,具有以上3种类型表现。平扫、肝动脉期及门静脉期肿瘤边界部分边缘清楚或有包膜，部分边缘模糊与正常肝组织分界不清，呈以上3种类型表现。1例动脉期、门静脉期均未见明显强化；2例动脉期瘤体边缘呈低密度，门脉期未见明确肿瘤边缘。1例肝内单发转移。
2.2 增强前后肿瘤大小的比较
平扫64例肿瘤，增强后动脉期53例显示瘤灶大小与平扫基本一致，3例大于平扫；门静脉期15例与平扫、动脉期相当，23例表现瘤体缩小，小于平扫和动脉期。41例门静脉期较动脉期更清楚、光整、锐利。
2.3 肿瘤边缘CT强化特征与肝内子灶及病理表现
2.4 大体病理、HE、免疫组化染色结果
肉眼观察：肿瘤有明确的纤维结缔组织包膜14例；肿瘤无明确包膜，但边界清晰27例；肿瘤与邻近非癌变肝组织分界不清23例。33例发现肝内子灶，12例多发，21例单发。
组织切片HE染色及免疫组化染色：本组组织切片共192张，CT分型I型45张，Ⅱ型78张，Ⅲ型60张，Ⅳ型9张。
其中I型45张切片中36张包膜显示清晰完整，5张可见癌细胞浸润；余9张包膜不完整，5张可找到癌细胞。HE染色见有包膜，癌与正常组织分界清，间质内可见肿瘤血管丰富，癌灶核破裂多，核异型多，核染色深。
Ⅱ型78张切片中3张显示有较薄纤维结缔组织层，其中2张可见癌细胞；75张无包膜形成，40张癌组织与非癌变肝组织彼此呈交替生长，35张癌组织与非癌变肝组织之间分界清晰。CD34瘤灶周围中度染色，瘤灶分界清晰，对应切片见薄层包膜，CT见灶周环形强化。
Ⅲ型60张切片中3张显示有不完整包膜，60张均发现癌细胞浸润且癌组织与非癌变肝组织彼此呈交替生长，两者之间无明确分界。
Ⅳ型9张切片中3张显示有部分间质纤维化，9张均发现癌细胞。包膜形成不完整者癌细胞有向周围扩散的趋势。免疫组化染色明确显示肿瘤边缘MVD>30的38例中，18例肿瘤新生血管呈强阳性，l2例呈中度阳性，8例呈阳性。
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3 讨论
肿瘤与周围正常肝组织的界面为瘤体边缘。由于其病理类型、分化程度、血供情况及生长方式等不同。瘤体边缘形态也不相同。肝癌的CT边缘形态特征，不但反映了肝癌的生长方式，而且与肿瘤血管生成程度有关。肿瘤血管生成或新生是肿瘤生长与转移的先决条件，它可以反映肿瘤的生物学行为与特点。微血管密度（microvessel density,MVD）测定技术一直为公认的评价肿瘤血管生成的“金标准” .MVD计数临床上常用的有HepParl、CD34、CD10.HepParl是以石蜡包埋的肝组织作为抗原克隆出的一株新的单克隆抗体，它是一种线粒体相关抗体，不针对胚胎性蛋白，因而其标记率与AFP无关 7 J HepParl对成人和胎儿肝细胞以及肝外发生的肝样腺癌呈高度特异性，对HCC的阳性率在66.7% ~100.0%.¨偶尔表达于其他肿瘤¨ J.
CD34最初为造血干细胞抗原，可在正常和新生的血管内皮细胞中表达。其在显示血管内皮细胞时，其特异性最高，优于内皮细胞的其他标记物。CD34是血管源性肿瘤的特异性标记物之一，在血液系统以外的其他实体性肿瘤中较少表达。尽管CD34本身并不直接显示HCC细胞，但HCC组织中CD34阳性的微血管分布形式或“HCC型染色”方式也可被视为较特异的诊断依据。近年来用于鉴别HCC和其他腺癌的CD10不仅表达在正常肝组织而且还表达在肿瘤性的肝组织，与CEA相似，也是特定的小管染色。CD10呈特征性的细胞间小管状、分支状或逗点状着色，HCC 中的阳性表达率为46.7% 一86% [9,14-15j,并且尚未发现其他肿瘤有此特征性的着色，故CD10表达及其着色方式的不同，对肝脏肿瘤的鉴别诊断具有一定帮助。本课题所采用Hep-Parl、CD34、CD10染色效果均很好反映了癌边缘的血供情况。
当肿瘤血管生成较多，营养供应丰富，瘤细胞生长就会越活跃，肝癌细胞呈膨胀性生长，肿瘤压迫周围的正常肝组织，而使肿瘤边界清楚。部分肝癌细胞由于增长较慢，对邻近的非癌变肝组织产生压迫，引起纤维结缔组织增生；同时，由于肿瘤细胞及其间质细胞产生大量促进血管生成的细胞因子，使纤维结缔组织内血管生成活跃形成所谓的肿瘤包膜。
CT显示的假包膜是瘤灶整体或局部呈膨胀性生长的直接征象 ,其CT表现为：平扫及增强各期显示的围绕肿块的低密度影或环形增强影。包膜主要由胶原纤维组成，但其中可有较多的网状纤维呈同心圆排列，表现为肿瘤膨胀性生长，有挤压原肝组织网状纤维的迹象，但在浸润和突破处，网状纤维散乱、断裂，表明有癌细胞对肝组织的直接破坏和浸润。
有关PHCC肿瘤边缘供血情况Ueda认为PHCC中心部分以肝动脉供血，而肿瘤与肝实质交界的边缘部分门静脉也参与供血，肿瘤边缘部的血液间隙可直接与非瘤区的血液间隙相通，肿瘤血流可经邻近肝的门静脉血管、肿瘤窦状隙、假包膜内层的细小血管和假包膜外层门静脉血管流人肿瘤周围肝组织。肿瘤边缘因为门静脉血供的存在，门静脉期肿瘤缩小，小于平扫及动脉期，说明动脉期较门静脉期更能真实反映肿瘤的实际大小和范围。
本组研究CT双期增强肿瘤边缘显示清晰者41例，组织病理切片观察16例有包膜，其中3例包膜不完整，1例包膜较薄。另25例无明显的纤维结缔组织包膜，但癌组织与非癌变肝组织之间分界清晰。其中22例动脉期肿瘤边缘呈低密度而门脉期呈低或高密度，仅2例发现肝内子灶，部分组织切片可见纤维结缔组织包膜，部分未见包膜形成，瘤体边缘或包膜内癌细胞较少，17例MVD≤30.CT上表现为此种类型，瘤体以膨胀性生长为主伴或不伴包膜形成，组织切片见完整包膜或部分可见包膜，部分未见明显包膜，无完整包膜者可能与肿瘤的形状欠规则有关。说明此种类型的PHCC其生长速度均较慢，肿瘤边缘或包膜内癌细胞浸润率极低，阳性血管生成较少，因此极少发生肝内转移，预后相对较好。l9例动脉期肿瘤边缘呈高密度、门脉期或呈高密度或边缘不清，肝内发生子灶12例，癌细胞浸润率较高，15例MVD>30.此种类型瘤体膨胀性生长的同时由于肿瘤细胞及其间质细胞产生大量促进血管生成的细胞因子，使纤维结缔组织内血管生成活跃所致。肿瘤边缘新生血管异常丰富，但血管壁基底膜不完整、内皮欠连续 ,因此肿瘤细胞容易穿透不完整的血管壁进入血循环，从而导致肝内和远处器官的转移。本组研究表明CT上动脉期肿瘤边缘呈高密度、门脉期或呈高密度或边缘不清的PHCC膨胀性生长的速度非常快，对周围正常肝组织产生压迫，HE显示肿瘤边缘癌细胞浸润率较高，免疫组化亦可见新生阳性血管，发生肝内及远处转移的几率大，预后相对较差。
CT双期增强肿瘤边缘显示不清晰者23例，组织病理切片1例可见较薄的不完整结缔组织包膜，1例部分间质纤维化，并见癌细胞浸润。其余组织病理切片均未见明显的结缔组织包膜，癌组织与非癌变肝组织呈交替生长、无分界。本组23例CT动脉、门脉双期均未显示明确的肿瘤边缘或动脉期未显示明确肿瘤边缘、门脉期显示肿瘤边缘呈高密度及动脉期显示肿瘤边缘呈低密度而门脉期未见明显边缘，MVD>30有18例，肝内发生子灶19例。动、门脉双期CT表现为肿瘤边界不清是由于肿瘤呈侵袭性生长且生长迅速所致，肝动脉及门静脉均参与肿瘤边缘部的供血，肝内子灶的发生率亦较高。病理观察肿瘤边缘癌细胞侵润率达到了100% ,阳性血管十分丰富，癌细胞分化的恶性程度非常高，说明发生肝内及远处转移的几率非常高。CT上表现为此种类型，预后极差。
综上所述，病理观察能直接显示肿瘤边缘部的真实状况，而CT双期扫描结果是对这种真实状况的反映。不同增强时相的组合及增强不同的表现方式反映肝癌的病理改变及血液动力学变化，对肝癌的早期诊断及疗效观察十分重要。