TLR2 基因稳定沉默膀胱癌细胞株T739 -TLR2Δ 建立及生物学
1. 引言卡介苗（bacillus Calmette-Guérin,BCG）膀胱内灌注治疗和预防浅表性膀胱癌，是目前较成功的肿瘤免疫治疗方法之一。其作用认为与BCG诱导的天然免疫反应有关，但其分子免疫机制尚不清楚。Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）是先天性免疫模式识别受体（patternrecognition receptor）之一，分布于单核细胞、内皮细胞、上皮细胞等，其中TLR2、TLR4分布广泛，目前发现其配体主要是微生物或微生物细胞壁成分，TLRs可识别与其接触的病原微生物，产生免疫反应。有研究[1-2]显示膀胱上皮细胞表达TLR2、TLR4,且能直接对BCG产生免疫反应，我们推测BCG也可能直接通过激活TLRs信号转导通路而增强抗肿瘤免疫反应。我们研究发现BCG刺激膀胱癌细胞株T739可引起TLR2/4-NFκB p65信号通路相关基因表达变化[3],为研究TLR2受体在NFκB p65信号通路的作用，应用基于载体表达的RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）阻断膀胱癌T739细胞株TLR2基因的表达，建立TLR2基因稳定沉默的细胞株。
2. 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和细胞TOP10 Chemically Competent E. coli、BLOCK-iT? Pol II miR RNAi Expression VectorReagents购自invitrogen公司；膀胱癌细胞株（BTT-T739,简称T739）源于小鼠低分化移行上皮细胞膀胱癌，购自上海市第一人民医院中心实验室[4].
2.1.2 试剂与仪器革兰氏阴性菌脂多糖（LPS） 和Blasticidin为Sigma进口分装，壮观霉素（Spectinomycin）购自昆明积大制药公司，CCK-8试剂购自碧云天生物技术研究所。Lipofectamine? 2000Transfection Reagent、PureLink? HiPure Plamid Midiprep Kit、T4 DNA Ligase、LigationBuffer、Annealing Buffer、TRIZOL购自Invitrogen公司、TIANScript RT Kit和SYBR Green荧光染料qRT-PCR试剂购自天根生化科技公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；anti mouseTLR2抗体购自eBioscince公司，Alexa Fluor?488 goat anti mouse IgG1购自Invitrogen公司，Annexinv-FITC凋亡检测试剂盒购自深圳晶美公司。荧光定量PCR仪（7700,ABI公司）、凝胶成像系统（Gel doc XR,BIO-RAD公司）、流式细胞仪（FC500,BECKMAN COULTER公司）。激光共聚焦显微镜（Leica公司）。
2.2 方法
2.2.1 细胞培养T739 细胞用含10%胎牛血清RPMI1640,37℃ 5% CO2 培养。
2.2.2 引物和miRNA设计引物应用Invitrogen OligoPerfect ? Designer 软件设计， 用BLAST 比对。TLR2（NM_011905.3） 引物： 上游5'-AAGAGGAAGCCCAAGAAAGC-3' , 下游5'-CAATGGGAATCCTGCTCACT-3',产物长度80 bp;Rel A（NM_009045.4） 引物：上游5'-ACCGAAGCAGGAGCTATCAA-3',下游5'-GCGTACACATTCTGGGGAGT-3',产物长度179 bp;CCL2（NM_011333.3） 引物：上游5'-AGCACCAGCCAACTCTCACT-3',下游5'-CGTTAACTGCATCTGGCTGA-3',产物长度136bp;ICAM1（NM_010493.2） 引物：上游5'-AGCACCTCCCCACCTACTTT-3',下游5'-AGCTTGCACGACCCTTCTAA-3', 产物长度160 bp;GAPDH （NM_008084.2） 引物：上游5'-TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3',下游，5'-AGATGGTGATGGGCTTCCCG-3', 产物长度156 bp.
miRNA应用Invitrogen RNAi Designer设计，针对小鼠TLR2基因（GenBank:NM_011905.3）编码区（ORF）不同位置靶序列，设计3对miRNA前体序列（表1），顶端链（5'-3‘）包括以下要素 （1） 5'TGCTG,（2） 21nt 靶序列的互补序列，（3）末端环： GTTTTGGCCACTGACTGAC, （4）靶序列的1-8 nt,（5） 靶序列的11-21nt;底端链产生：（1）移除顶端链 5' TGCT,（2）取顶端链的互补链，（3）在第2步所得序列5’端加CCTG.
2.2.3 miRNA表达的重组质粒构建miRNA前体双链退火后与pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR （linearized）连接，转化E. coliTOP10,涂布含Spectinomycin 50μg/ml的LB平板，过夜培养；挑取单菌落在含Spectinomycin50μg/ml 的LB 培养12h , 提取质粒， 命名为pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.949 、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.1725、pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.2264（简称pc 1#、pc 2#、pc 3#），X hol 酶切后用1%琼脂糖电泳，并测序鉴定。
2.2.4 miRNA表达质粒转染效率接种T739细胞于6孔板或爬片，加入含10% FBS无抗生素RPMI 1640培养基2ml,待细胞融合约85%,用Lipofectamine?2000与质粒混匀转染细胞，孵育6 h后更换新鲜培养基继续培养24h、36h和48h,用流式细胞仪（FCM）和激光共聚焦显微镜（LSCM）分别观察GFP阳性表达细胞。
2.2.5 最佳miRNA表达载体筛选质粒转染后培养48h,qReal-Time PCR方法检测TLR2 mRNA表达，以GAPDH为内参基因，循环条件：94℃ 2 min,94℃ 20s 60℃ 20s 68℃ 5s, 40个循环。TLR2 mRNA相对表达量采用公式[5] Ratio=EtargetCT（control-sample）/Eref CT（control-sample） ,E代表扩增效率，CTcontrol 和CTsample表示正常细胞和转染重组质粒细胞样本的CT值。
2.2.6 稳转细胞株筛选与干扰效率T739细胞贴壁后更换含不同浓度杀稻瘟菌素（Blasticidin）（0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/ml）的完全培养基，确定杀死正常T739细胞的最低浓度。将沉默效果最佳的重组质粒转染细胞，按1:
35比例传代，用含Blasticidin的培养基培养，待瓶底出现单个细胞克隆，挑取8个克隆传代培养。用qReal-Time PCR仪与流式细胞仪检测TLR2 mRNA和受体表达。连续传代一个月，每代均检测TLR2 mRNA和受体表达。
2.2.7 T739 -TLR2Δ细胞生物学特征细胞增殖能力 制成细胞悬液5×104个/mL,接种96孔板，每孔100 μL,在0h、12 h、24h、36h、48h每孔加入CCK-8溶液10uL,孵育2 h,检测A 450 nm,并做空白对照；绘制细胞生长曲线，并计算细胞群体倍增时间（Doubling time,DT），DT[6]=（t-t0）（1g2/lg（At/A0） （t代表检测时间），将各时间点DT均数作为该细胞群体倍增时间。
细胞周期 收集细胞制成混悬液0.5ml,加入NIM-DAPI 0.5ml混匀，静置10min用流式细胞仪检测。用MultiCycle 分析计算细胞增殖指数（proliferation index , PI） : PI=（S+G2/M）/（ G0/G1+S+G2/M） x 100%.
细胞调亡 调整细胞密度为1 x 109个/L,取细胞100μL,加入FITC-Annexin-v 5μL和PI10μL混合，室温避光孵育15 min后流式细胞仪检测。
对脂多糖（LPS）反应 LPS浓度为100μg/L,作用时间2h,qReal-Time PCR检测RelA（NF-κB P65）、CCL2和ICAM1 mRNA表达。
2.2.8 统计学分析实验数据用（（±s）表示，进行t检验，采用SPSS统计学软件做单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。mRNA表达以Ratio>2或Ratio<0.5为有差异。
3. 结果
3.1 miRNA表达载体的构建
3个菌落质粒经X hol酶切产物电泳显示质粒完整，片段长度相符；测序结果显示miRNA表达序列双链存在，该双链插入方向正确，未出现变异碱基，测序结果与设计的序列一致。
3.2 miRNA表达载体转染效率
以GFP阳性表达细胞为检测指标，收集6孔板细胞用流式细胞仪（FCM）检测，在24h未检测到GFP阳性表达T739细胞，36h和48h均可观察到GFP阳性表达细胞，阳性率70%~85%;细胞爬片用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察，结果与流式细胞仪相近。
3.3 沉默效果最强的miRNA表达载体
转染不同miRNA 表达载体的细胞TLR2 mRNA 相对表达量（Ratio）均有不同程度的下降，其中pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.949 重组质粒转染一次后沉默效果最强，可降低约65%表达量。
3.4 建立稳转细胞株
杀死正常T739细胞Blasticidin最低浓度为5 μg/ml,用含5 μg/ml Blasticidin 培养基培养转染pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.949的T739细胞，筛选出亚克隆细胞株T739 -TLR2Δ，TLR2 mRNA和TLR2受体下降显著，分别约为90%和95%.连续传代1个月后，TLR2 mRNA和TLR2受体表达均稳定。
3.5 T739 -TLR2Δ细胞生物学特征
细胞增殖能力检测 正常细胞，阴性对照细胞（T739-miR neg）和T739 -TLR2Δ细胞各时间点细胞生长曲线显示T739 -TLR2Δ细胞群体倍增时间延长，各细胞倍增时间分别为18.1h,18.3h,25.1h,正常细胞与阴性对照细胞倍增时间无显著差异（P>0.05），T739 -TLR2Δ细胞与正常细胞、阴性对照细胞倍增时间有显著差异（P<0.05）。
细胞周期分布 T739、T739-mi R neg和T739-TLR2Δ细胞增殖指数（PI）分别为 65.0%、64.5%和52.1%,T739 -TLR2Δ与T739相比降低显著（P<0.05） , T739 -TLR2Δ和T739-mi R negcontrol细胞无显著差异（P>0.05），均未观察到凋亡峰和异常峰。
细胞调亡检测 T739 -TLR2Δ细胞形态正常、贴壁生长均良好，无脱壁细胞，与T739和T739-miR neg control细胞相似，Annexin-V的阳性率均低于2%.
对脂多糖（LPS）的反应 基因的相对表达量（Ratio）以T739细胞为参比，结果显示T739-TLR2Δ细胞对LPS的反应明显减弱，LPS作用T739 -TLR2Δ细胞后CCL2与ICAM1 mRNA表达明显降低（Ratio<0.5），RelA mRNA表达变化不明显。
4. 讨论
RNA干扰现象本身是生物进化过程中细胞的一种保护性机制，机体可因此避免外源性基因（如病毒、转座子）在宿主细胞内表达，清除一些生命发育过程中出现的异常mRNA.RNAi技术近年来广泛应用于基因功能分析的研究领域，RNAi提供了一种高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究基因在生物模型系统中的作用，是进行基因功能研究的重要工具[7].
为了研究TLR2基因在BCG治疗膀胱癌方面的天然免疫的分子作用机制，需建立TLR2基因表达沉默的实验细胞株，RNAi技术则是一种方便、高效的技术，该技术可以通过siRNA转染进行短暂干扰效应，也可通过基于载体表达的RNAi技术实现目的基因的稳定沉默，为更充分研究TLR2基因在BCG治疗膀胱癌方面发挥的作用，我们选择使用基于载体表达的RNAi技术。针对小鼠TLR2基因编码区（ORF）不同位置的靶序列，设计3对miRNA前体序列， 成功构建3 个miRNA 表达载体， 并筛选出瞬时干扰效果最佳的载体pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR- TLR2.949.转染该载体，应用Blasticidin抗性筛选出稳转细胞，并传代1个月检测TLR2表达水平仍能保持相近的下调效果，从而为未来的实验提供了基础。
细胞生物学特征考查发现，稳转细胞T739 -TLR2Δ的群体倍增时间延长，细胞增殖指数下降，但细胞形态正常、贴壁生长良好，无明显凋亡细胞。而以往文献报道RNAi沉默的目的基因多为肿瘤生长或细胞周期调控相关基因，并出现细胞增殖能力下降[8-9],而此实验发现沉默TLR2基因也出现细胞生长受抑制的现象，在多数肿瘤细胞NF-κB通路是组成性或持续性活化[10],这可能由于TLR2基因表达缺失会抑制NF-κB等转录因子的活化，从而抑制转录因子下游与细胞增殖相关基因的表达，从而导致细胞群体倍增时间延长；也可能由于转染载体表达的microRNA-TLR2打破细胞内自身microRNA组成的平衡，进而影响生长调控相关的蛋白表达。该原因尚需要进一步探讨，可比较TLR2基因沉默前后NF-κB核转入活性，或比较稳转细胞T739 -TLR2Δ与T739细胞micro RNA表达谱等。对细胞TLR2沉默也进行了初步的功能考查，应用LPS刺激细胞后，T739 -TLR2Δ细胞的CCL2和ICAM1 mRNA表达明显下降，而RelA（NF-κB P65） mRNA无明显改变，从功能验证了TLR2基因沉默的效应。RelAmRNA无明显改变，可能在NF-κB信号通路中NF-κB P65通过核的移位来调节信号通路，而NF-κB P65mRNA并无明显变化。总体评价该，该实验建立的细胞株T739 -TLR2Δ可用于研究TLR2基因在膀胱癌上皮细胞T739中的功能。
参考文献
[1] 龚志勇，李响，毛普德，等。膀胱癌细胞钟声蛋白样受体表达与卡介苗诱导。中国肿瘤。2004,13（1）
[2] Miyazaki J, Kawai K, Oikawa T, et al. Uroepithelial cells can directly respond to Mycobacterium bovisbacillus Calmette-Guérin through Toll-like receptor signalling. BJU Int. 2006 ,97（4）：860-864.
[3] 危建安，曾星，韩凌，等。卡介苗经TLR4 介导对膀胱癌细胞株T739 NFκB p65 活性影响。细胞与分子免疫学杂志
[4] 李凌，武文森，徐萍，等。一种新的高转移膀胱癌动物模型的建立。中华实验外科杂志， 2002, 19（1）：78-79
[5] Pfaffl MW. new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2001, 29（9）：2002-2007.
[6] Suga H,Shigeura T,Matsumoto D,et a1.Rapid expansion of human adipose-derived stromal cells preservingmultipotency.Cytotherapy,2007;9（8）：738
[7] Ramaswamy G, Slack FJ.siRNA:A guide for RNA silencing[J].Chem Biol,2002,9（10）：1053-1055
[8] Hao JH, Gu QL, Liu BY,et a1. Inhibition of the proliferation of human gastric cancer cells SGC-7901 invitro and in vivo using Bcl-2 siRNA. Chin Med J （Engl）。 2007 ,120（23）：2105-2111
[9] Liu F, Yu ZJ, Sui JL, et a1. siRNA-mediated silencing of Cockayne Cyndrome group B gene potentiatesradiation-induced apoptosis and antiproliferative effect in HeLa cells. Chin Med J （Engl）。 2006 ,119（9）：731-9.
[10] 1. Van Waes C.Nuclear factor-kappaB in development, prevention, and therapy of cancer.Clin Cancer Res,2007,13（4）：1076-82.