小议散发性先天性巨结肠症内皮素受体B基因
先天性巨结肠（Hirschsprung's disease, HD）是儿外科最常见的消化道畸形疾病之一，临床上以长期便秘、肠梗阻等为主要表现，因病变处肠管神经节细胞先天缺失而发病。目前研究均认为HD是一种多基因遗传病，遗传度介于65%~80%,以酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RET）、内皮素受体-B（endothelin-B receptor, EDNRB）为主要基因外牵涉达十余种基因，并认为易患基因的突变与单核苷酸位点的多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）与发病密切相关。其中RET基因的研究较多，而EDNRB基因在国内尚未见大样本并涉及基因全长的报道。本研究探讨EDNRB基因外显子2在中国人散发性先天性巨结肠（sporadic HD, SHD）中的突变与多态性位点情况，比较不同种族的异同，现将结果报告如下。资料与方法
一、临床病例
连续性收集2002年1月~2004年12月武汉地区多家医院与山西省儿童医院手术病理证实的散发性HD患儿92例，男：女=3.8:1（73/19），中位年龄14个月（2~192个月）。其中短段型66例，长段型18例，全结肠型8例。均无家族史或合并其它畸形，并收集其中32例患儿双亲的标本。另取正常儿童60例作对照。
二、DNA提取与聚合酶链反应
抽取研究对象外周静脉血2 mL,EDTA抗凝，以盐析法提取DNA后溶于TE缓冲液中，分光光度计测定DNA的浓度与纯度，-20℃保存备用。引物序列参照文献[1]，由上海生工生物工程有限公司合成，序列为EDNRB-2F : 5'- AGTGATACAATTCAGAGGGC -3',EDNRB-2R : 5'- TACTTGGATTAAATAGAAGC -3',目的片段长度为203 bp.50 μL PCR反应体系含DNA模板2 μL（50~200 ng），10×buffer 5 μL,2.0 mmoL/L MgCl2, 上下游引物各2 μL（终浓度0.4 μmoL/L），1 μL dNTP混合物（终浓度200 μmoL/L），Pfu DNA聚合酶 1 μL（2 U）。PCR反应条件：95℃预变性3 min,进入循环：94℃变性 30 s,49℃退火 40 s,72℃延伸 30 s,共35个循环，最后72℃延伸10 min.所得产物以2%琼脂糖凝胶行电泳。
三、单链构象多态性（SSCP）分析及产物测序
制备8%（49:1）非变性聚丙稀酰胺凝胶，其中含5%甘油，2 μL PCR产物与5μL上样缓冲液混合（93%甲酰胺，10 mmoL/L EDTA,0.025%二甲笨青）后95℃变性10 min,冰浴骤冷后上样，4℃凝胶电泳，120 V电泳10 h（至二甲苯青到达胶底部）。电泳结果银染后观察，发现有异常条带的PCR产物纯化后经DNA自动测序仪测序（上海博亚生物技术有限公司）。
结果
一、PCR产物的电泳结果
PCR产物均显示单一亮带，且与正常对照的扩增片段位置一致，均处于Marker所示的适当位置，表明所得PCR产物确为EDNRB基因第2外显子片段，并且扩增片段上无大片段的插入与缺失。
二、SSCP银染结果
对92例HD患儿以及32例患儿的双亲与60例正常对照的PCR产物进行SSCP银染分析。结果发现，所有样本除含有与正常对照一致的两条单链条带与一条未变性完全的双链条带外，均未发现异常泳动条带。重复实验仍未发现异常泳动条带。
三、DNA测序结果
任选正常对照、长段型、全结肠型与短段型及其双亲的PCR产物进行双向测序，测序结果与GenBank中EDNRB基因（GI:4557546）标准序列比较均完全一致，未发现突变与多态性位点的存在，并且所研究样本中未发现文献报道的第184位（TCC→TCT）与187位密码子（ATC→ATT）的同义突变以及第185位密码子（GTG→ATG）的错义突变。
由于HD是一种常见的先天性消化道畸形，其遗传背景在发病中的作用更是受关注，多年来HD的病因探讨一直作为研究重点。目前，HD被确定为多基因遗传病，涉及RET、EDNRB、GDNF, EDN, SOX-10, NTN等十余种候选基因。其中，研究最多的RET基因被认为是与HD发病最密切，但RET基因突变与多态性只能解释50%的家族性HD与15%~20%的SHD.Hosoda等[2]通过体外杂交实验证实， EDNRB基因缺失可以使实验鼠产生巨结肠，并且所引起的结肠损害是短段肠壁内无神经节，比RET基因缺失导致的全消化道缺乏神经节细胞及肾脏损害的动物模型，更接近于人类临床上的HD.另外，SHD以短段型最多见。因此，对EDNRB基因的研究是探讨HD发病的另一重要方向。
EDNRB基因位于13q22,含7个外显子和6个内含子，编码含443个氨基酸的功能蛋白质，该蛋白为G蛋白耦联的跨膜受体蛋白，介导的信号通路对肠神经节细胞的移行发育起重要作用。sHD患者EDNRB基因突变率达2.1%~10.7%,其中短段型的突变率更高，突变基因产物的作用可能受到影响。近年通过转染对突变受体功能的研究发现，突变后受损可见于多个环节，有的突变虽不改变配受体的亲合力，却使结合后钙内流的增加降低或对腺苷酸环化酶活性的抑制作用降低，引起细胞内信号传导受损；有些突变受体的分布发生改变，如近细胞核而在细胞膜上缺乏，与配体的结合几率降低；有些突变的受体与野生型具有相同的亲合力和功能特性；有些突变后与内皮素-1缺乏亲和性，减弱诱导钙内流与激活AP-1通路的作用；有些突变存在Galphai信号通路缺陷，影响肠管神经元细胞的分化等[3,4]。EDNRB突变后的功能改变复杂，机制尚待深入研究。
SNPs在多基因遗传病中的作用越来越被重视，是单个核苷酸改变而引起的DNA序列多态性，在人群中的发生率高于1%.分析国外文献，发现不同种族、国家可能遗传背景相异等，表现为EDNRB基因突变或多态性有相似性，更多的是差异（表1）。该基因已发现的突变或多态性位点有19种以上，主要分布于7个外显子，以外显子4为最多，未发现明显的突变热点，但L277L（G→A）在亚非种族都有突变或多态位点的报道，而欧美种族中尚无。还发现sHD的EDNRB基因突变基本为杂合性突变，仅Sakai等[1]报道一例女性短段型L277L纯合子突变。复习文献后，我们认为L277L更确切的提法应是多态性位点（正常人中亦存在，并且等位基因A频率﹥1%）。文献报道EDNRB基因纯合子突变仅见于Waardenburg-Hirschsprung 综合征，而杂合子突变见于散发性与家族性HD,反映EDNRB突变可能存在剂量敏感性，杂合子发病倾向于无综合征的HD[5,6]。
国内sHD研究尚无EDNRB基因外显子2、7的报道，但在3、4、5及6外显子已有突变或多态位点的研究[7-9] （仅外显子4有测序证实）。本研究SSCP未发现sHD患者外显子2存在异常泳动条带（图2），经测序也证实无差异碱基，说明该片段的突变率0%,国外仅南非患者密码子184与187存在着多态性位点[10]，我国香港亦发现第185位密码子G→A的多态，而台湾地区也未发现此片段的多态（图3）。一方面可能中国人EDNRB基因外显子2与大多数种族相一致，大陆人与香港人间可能有差异；另一方面可能该片段高度保守，在HD发病中的作用微弱。
综上所述，EDNRB基因与sHD发病密切相关，并有上一代突变者并不发病的病例，说明该基因有着不完全的遗传外显率。EDNRB蛋白在细胞信号传导中的具体机制以及对肠内神经系统发育迁移所产生的作用仍需更深入研究，才能为HD的基因治疗提供参考。
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