小议氡慢性染毒改变大鼠肺组织蛋白的表达
0. 引言氡及其子体是人类遭到自然辐射的主要来源，已明白为I类致癌物。对矿工中的盛行病学研讨以为100WLM的氡暴露即可使肺癌风险增加，并与暴露量成直线关系[1]。氡及其子体进入呼吸道后，分离态的氡子体主要堆积在肺部，未分离的氡子体主要堆积在鼻咽部和气管－支气管区，故从鼻咽部到细支气管、肺泡都可直承受到高传能线密度的α粒子映照。
固然盛行病学调查已证明氡暴露可增加肺癌发作的风险度，但是对动物的实验研讨还很少报道，可能与染毒的安装和条件有关。本研讨采用长期慢性染毒，察看氡暴露对大鼠肺组织的损伤及蛋白表达的改动，为讨论氡致肺癌的机制提供实验材料。
1. 资料和办法
1.1 资料
1.仪器：多功用生态氡室（华东地质学院制造）。超声细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。高速离心机（Beckman 公司）。Brastead 超纯水安装（美国DUBUQUE）。酶标仪（BIO-TEK）。Mini 垂直电泳仪、电转仪（Bio-Rad 公司）。
2.试剂与资料：一抗小鼠来源PCNA 单克隆抗体 （Snatacruz，USA），RAGE 抗体（R&DSYSTEMS，USA），S100A6 抗体（Abnova Coporation，Taiwan），内参β-actin 抗体（Snatacruz，USA）。二抗羊抗鼠辣根过氧化物酶HRP-IgG （Proteintech Group，USA）。（Amersco, USA）。
聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜）、彩色预染MARKER、ECL 化学显色剂、Western 一抗二抗去除液、显影定影液（碧云天生物技术研讨所）。X 线胶片，暗盒 （Kodak 公司）。
1.2 办法
1. 实验动物及染毒条件：安康雄性Wistar 大鼠8 只，体重（100±10） g，由中科院上海动物中心提供（动物证号：中科动管会第001 号） 。随机分为正常对照组和氡染毒组，每组4只。染氡组大鼠整体暴露于多功用生态氡室，经过计算机控制氡室内浓度，坚持恒定剂量率100000Bq/KL，每天染毒16h，染毒时间持续约2 年零3 个月。染毒完毕时，氡的累积剂量达650WLM。对照组饲养于本底环境，正常饮水和进食。
2. 肺组织的别离及总蛋白提取：染毒完毕后用5% 水合氯醛麻醉大鼠（1ml/100g），开胸暴露气管和肺，右肺结扎，10％中性福尔马林固定，作常规HE 染色察看肺损伤状况。左肺气管灌洗和心脏灌洗以去除肺泡杂质和肺循环血液，取同一部位组织停止肺组织蛋白提取。
提取步骤为：肺组织100 mg 左右，参加1 mL 蛋白裂解液RIPA，冰上研磨至无组织块。
液体搜集入离心管中，冰浴超声粉碎2 s，静置3 s，超声24 次共2 min，冰上静置至无泡沫。
40000 g，4℃，离心30 min，搜集上清，Bradford 法测定蛋白浓度，分装冻存于-80℃备用。
3. PCNA、RAGE 和S100A6 蛋白的Western blot 剖析：每只大鼠肺组织总蛋白分别采用化学发光ECL 显色法停止 Western blot 剖析，步骤为：每例标本取总蛋白50 μg，3%SDS-PAGE 浓缩胶80 V 电泳至别离胶，10%别离胶110 V 电泳至溴酚蓝跑到底部；制备海绵-滤纸-胶-PVDF 膜-滤纸-海绵“三明治”，110 mA 1.5 h 电转印于PVDF 膜上。封锁液（5％脱脂奶粉，1×TBST 缓冲液）室温振摇封锁2 h。一抗PCNA（1:200 稀释），RAGE （1:500稀释），S100A6（1:500 稀释），内参β-actin（1:500 稀释）分别与经封锁液处置的PVDF 膜4℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min。二抗l:1000 稀释，室温孵育1 h。TBST 洗膜5次，每次10 min。加ECL 发光剂，在l～20 min 内显影、定影，胶片洗濯枯燥后，扫描剖析。
4. 统计剖析病理切片HE 染色，光镜察看判别规范如下：（1）正常支气管上皮：细胞呈柱状或立方形，位于基膜细胞的外表抵达管腔，并有纤毛伸出。（2）鳞状上皮化生：上皮由数层规则的扁平细胞组成，可见角化。（3）不典型增生：上皮由数层不规则细胞组成，表现为增生的细胞大小不一，形态多样，核大而浓染，核浆比例增大，核团结可增加，呈多型性。（4）原位癌：不典型增生严重时，细胞累及上皮的全层则定为原位癌。Western blot 图像采用bandscan4.3 图像剖析软件停止剖析，以β-actin 为内参，剖析PCNA，RAGE，S100A6 的相对表达量，计算均匀值。
2. 结果
2.1 动物根本状况
在饲养及染毒过程中，对照大鼠及染毒大鼠均有死亡，对照组大鼠一年零10 个月死亡1 只，一年11 个月死亡1 只；染毒组大鼠一年11 个月死亡1 只，两年零1 个月死亡1 只。死亡大鼠经组织病理切片，证明为心衰和肺水肿致死亡。存活大鼠实验完毕时对照组体重均匀367g，染毒组体重均匀330.5g。
2.2 肺组织病理改动
大鼠肺组织HE 染色结果见图1，与正常对照组（图1A,B）相比，氡染毒组肺间质充血水肿，肺泡距离增厚，炎症细胞浸润，肺泡腔逐步萎缩变小。局部肺泡距离断裂，呈现肺气肿样变。染毒组一只大鼠左肺组织呈现局灶性肺泡上皮细胞的不典型增生，可见大量增生的肺泡上皮细胞浸润肺泡距离，增生的细胞形态多样，核大而浓染，核浆比例增大，核团结相增加，呈严重的增生性和多型性改动。
2.3 肺组织中PCNA、RAGE 和S100A6 的表达
Western blot 结果可见，各组样品的内参β-actin 条带的灰度值比拟均匀，而PCNA 蛋白的灰度在染毒组呈高表达。RAGE 和S100A6 蛋白在染毒组大鼠也呈现高表达。用Bandscan4.3 软件剖析PCNA、RAGE 和S100A6 的灰度值，以β-actin 为内参，计算PCNA、RAGE 和S100A6 的相对表达量，结果见图2，可见PCNA、RAGE 和S100A6 在氡染毒组大鼠肺组织中的表达显著增高。
3. 讨论
恶性肿瘤是一类由遗传要素与环境要素共同作用所招致的疾病，其发作和停顿是多要素、多环节、多阶段的过程。当正常支气管上皮细胞遭到致癌物的长期刺激后，可呈现增生改动，严重的细胞增生可作为癌前病变的一种方式[2,3]。氡及其子体进入呼吸道后，分离态的氡子体主要堆积在肺部，未分离的氡子体主要堆积在鼻咽部和气管－支气管区，故从鼻咽部到细支气管、肺泡都可直承受到高传能线密度的α粒子映照。细胞增殖核抗原PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，其表达与细胞周期有关，主要表达于增殖细胞的S期、G1期和G2初期。PCNA表达越强，提示细胞的恶性化水平越高[4,5]。本实验结果显现，染毒组大鼠肺上皮细胞呈严重增生改动，并且PCNA表达明显高于对照组，阐明氡染毒大鼠肺组织曾经呈现较高的增殖活性，具有癌前病变的明显特征。
在我们的前期工作中，应用蛋白质组学技术挑选了一批氡染毒后大鼠肺组织差别表达的蛋白质，如晚期糖基化终产物受体（Receptor for advanced glycation endproducts, RAGE）、钙分离蛋白S100A6，硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）、膜联蛋白III、热休克蛋白HSP70 以及一些能量代谢酶等[6]。RAGE 是细胞外表分子中免疫球蛋白超家族的一个多配体受体，在体内散布十分普遍，可普遍表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞、肺泡上皮细胞等。
RAGE 最初发如今老年人和糖尿病患者表达增加[7]，近期研讨发现，RAGE 可调理癌细胞的生长、扩散和转移，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌以及肺癌等多种肿瘤中都呈高表达[8-10]。S100A6是RAGE 的一个主要配体，又叫钙分离蛋白，其散布与细胞内钙离子的浓度及与细胞进入S期有关，其作用机制也与钙离子分离相关，在钙离子信号转导中发挥重要作用。文献[10]报道，RAGE 和S100A6 蛋白在局部肿瘤组织如肺癌、结肠癌中均呈高散布，在MDA-MB-231细胞中经双重免疫染色，二者在细胞上的散布区域根本分歧。本实验发现两种蛋白同时高表达，提示二者在氡染毒惹起的支气管肺组织氧化损伤中起重要的互相作用，但二者经过何种信号通路改动而在细胞癌变过程中发挥作用值得深化研讨。
综上所述，本实验结果标明氡染毒可使大鼠肺组织发作增生性癌前病变，并诱导RAGE和S100A6 蛋白的高表达。由于样本量较小，结果未能显现剂量-反响关系，需求今后加大样本量后进一步研讨证明。
参考文献
[1] Lubin J. Lung cancer in radon-exposed miners and estimation of risk from indoor exposure. J Natl CancerInst, 1995,87:817-27.
[2] Ye B. Zhang YX. Yang F. Chen HL. Xia D. Liu MQ. Lai BT. Induction of lung lesions in Wistar rats by4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone and its inhibition by aspirin and phenethyl isothiocyanate.BMC Cancer. 7:90, 2007.
[3] Wang J. Chen HL. Zhu RQ. Diao LM. Jang M. Yang F. Liu MQ. Expression of apoptosis and proliferationrelated genes in carcinogenesis of lung squamous cell carcinoma in rats. [Chinese] Aizheng. 22（5）：471-6,2003 May.
[4] 苏文忠，韩福才。 肺癌相关肿瘤标志物的研讨停顿。 肿瘤研讨与临床。 2006,18（6）：428-430.
[5] Zhou H, Calaf GM, Hei TK. Malignant transformation of human bronchial epithelial cells with thetobacco-specific nitrosamine, 4-（methylnitrosamino）-1- （3-pyridyl）-1-butanone.2003, Int. J. Cancer,106:821-826.
[6] Xu N, Zhang S, Nie J, Dong L, Li J, Tong J. Radon-induced proteomic profile of lung tissue in rats. J ToxicolEnv Health A .2008, 71（6）：361-366.
[7] Ramasamy R，Vannucci SJ，Yan SS，et al. Advanced glycation end products and RAGE: a common thread inaging, diabetes, neurodegeneration, and inflammation[J]. Glycobiology，2005，15（7）：16R-28R.
[8] Kuniyasu H，Oue N，Wakikawa A，et al. Expression of receptors for advanced glycation end-products（RAGE） is closely associated with the invasive and metastatic activity of gastric cancer[J]. Journal ofPathology，2002，196（2）：163-170.
[9] Ishiguro H，Nakaigawa N，Miyoshi Y，et al. Receptor for advanced glycation end products （RAGE） and itsligand, amphoterin are overexpressed and associated with prostate cancer development[J]. Prostate，2005，64（2）：92-100.
[10] Hsieh HL，Schafer BW，Sasaki N，et al. Expression analysis of S100 proteins and RAGE in human tumorsusing tissue microarrays [J] . Biochemical & Biophysical Research Communications，2003，307（2）：375-381.