依替二膦酸锶体外骨靶向性实验
抗骨质疏松药物的研究中，锶盐已成为大家关注的热点之一。既往的研究表明，锶对机体和组织无毒性，适量锶盐在促进骨形成的同时能抑制骨吸收；锶是骨改建过程中，目前已知的唯一具有解耦联作用的物质[1]。雷诺锶盐经过严格的三期临床试验后，已于欧洲上市；大量的临床应用证明了其有效性[2]。大量关于锶盐的研究均是围绕其母体而进行的；锶盐的母体对其抗骨质疏松疗效的发挥和毒副作用的产生影响很大[3]。针对目前锶盐存在的用药剂量偏大、显效时间过长和生物利用度低等部分问题，作者设计并合成了一种新骨靶向药物—依替二膦酸锶；以依替二膦酸根作为锶盐的母体，两者拼合起来发挥协同效应。本实验拟以羟基磷灰石吸附实验为基础，以观察和评价依替二膦酸锶的体外骨靶向性。1. 材料与方法
1.1 药品及主要仪器
高纯度依替二膦酸锶、依替二膦酸二钠和二氯化锶（成都七星科技有限公司合成）；SolaarM6 原子吸收分光光度计；HP1100 高效液相色谱仪（日本惠普）；紫外检测器。
1.2.方法
锶测定方法---火焰原子吸收法FAAS，依替膦二酸测定方法---高效液相色谱法HPLC，HP1100 高效液相色谱仪，带紫外检测器。
2. 结果
2.1 依替二膦酸二钠羟基磷灰石（HA）吸附实验
2.1.1 依替二膦酸二钠HPLC 标准曲线
梯度稀释得到5.0～50.0μg/ml 的依替二膦酸二钠溶液，于高效液相色谱仪下测量并计算于230nm 波长处吸收曲线下的面积。将上表测得数据代入EXCEL 绘制标准曲线，并得到曲线方程：y=0.6081x+0.1201；同时得到浓度和曲线下面积的相关系数R2=0.9946。以上结果说明浓度和曲线下面积呈简单的线性相关，且其相关性很高。
2.1.2 依替二膦酸二钠吸附实验结果：
结果提示羟基磷灰石能明显吸附依替二膦酸二钠溶液中的依替二膦酸根，其吸附率在依替二膦酸二钠浓度一定时与的羟基磷灰石的剂量呈正相关。
2.2二氯化锶羟基磷灰石（HA）吸附实验
2.2.1 二氯化锶FAAS 标准曲线
梯度稀释得至5.0～50.0μg/ml 的二氯化锶溶液，通过FASS 法测定锶的吸收光度值；并将测得数据代入EXCEL 绘制标准曲线，并得到曲线方程：y=0.0114x-0.0082；同时得到浓度和吸光度值的相关系数R2=0.9992。以上结果说明浓度和吸光度值呈简单的线性相关，且其相关性很高。
2.2.2 氯化锶吸附实验结果：
结果提示羟基磷灰石对二氯化锶溶液中的锶离子的吸附性极低。
2.3依替二膦酸锶羟基磷灰石（HA）吸附实验
2.3.1 依替二膦酸锶HPLC 标准曲线
梯度稀释得至5.0～50.0μg/ml 的依替二膦酸锶溶液，于高效液相色谱仪下测量并计算于230nm 波长处吸收曲线下的面积，并绘制标准曲线。将测得数据代入EXCEL 绘制标准曲线，并得到曲线方程：y=0.2694x+0.219；同时得到浓度和曲线下面积的相关系数R2=0.9971。以上结果说明依替二膦酸锶浓度和曲线下面积呈简单的线性相关，且其相关性很高。
2.3.2 依替二膦酸锶吸附实验HPLC 结果：
羟基磷灰石能明显吸附依替二膦酸锶溶液中的依替二膦酸根，其吸附率在依替二膦酸锶浓度一定时与的羟基磷灰石的剂量呈正相关。
2.3.3 依替二膦酸锶FAAS 标准曲线
梯度稀释得至5.0～50.0μg/ml 的依替二膦酸锶溶液，通过FASS 法测定锶的吸收光度值；将测得数据代入EXCEL 绘制标准曲线，并得到曲线方程：y=0.0066x+0.0075；同时得到浓度和吸光度值的相关系数R2=0.996。以上结果说明浓度和吸光度值呈简单的线性相关，且其相关性很高。
2.3.4 依替二膦酸锶吸附实验FAAS 结果：
结果提示羟基磷灰石能明显吸附依替二膦酸锶溶液中的锶离子，其吸附率在依替二膦酸锶浓度一定时与的羟基磷灰石的剂量呈正相关。
3. 讨论
二膦酸盐对羟磷灰石的高亲和力是由其化学结构---双膦酸键（P-C-P）；与焦磷酸盐类似，二膦酸盐能够通过膦酸基团上的氧原子与钙离子双齿配位鳌合，故P-C-P 具有和羟基磷灰石高度亲和的特性。二膦酸盐与钙离子亲和性的大小和R1 链的结构有关，当其为羟基（OH）时，能和钙离子形成三齿配位鳌合，因此和钙离子的亲和力明显增加[4]。依替二膦酸根为1位碳原子上有羟基的二膦酸盐；本实验中其羟基磷灰石吸附率为13.2～24.4%，其骨靶向性明显。
锶原子作为人体内的微量元素，其99%以上沉积于骨组织，其在人体内的骨靶向性不容质疑[5]；然而，作为游离状态的自由离子（如氯化锶溶液）因其不能与羟基磷灰石形成键性结合或鳌合，更不能如体内那样取代钙原子掺入其中，故对羟基磷灰石无亲和性；本实验中其羟基磷灰石吸附率为0.4～1.2%，基本无骨靶向性。
体外羟磷灰石吸附实验证实：依替二膦酸根对羟磷灰石有明显的亲和力，且随着羟磷灰石量的增加，其对依替二膦酸根的吸附率也有明显的增加；羟磷灰石对氯化锶中的锶离子基本没有吸附作用；依替二膦酸锶溶液中的依替二膦酸根对羟基磷灰石亲和性无明显变化，且其中的锶离子也表现出近似于依替二膦酸根对羟磷灰石的高亲和力。
依替二膦酸锶盐溶液中的依替二膦酸根具有明显的羟基磷灰石亲和性和骨靶向性；依替二膦酸根能够显著增强溶液中锶原子对羟基磷灰石的亲和性，提高其体外的骨靶向性。
参考文献
1. Nielsen SP. The biological role of strontium. Bone, 2004,35:583-588
2. Reginster JY, Seeman E, De Vernejoul MC, et al. Strontium ranelate reduces the risk of nonvertebral fracturesin postmenopausal women with osteoporosis: TROPOS study. J Clin Endocrinol Metab 2005. （Published online 22Feb; doi: 10.1210/jc.2004-1774.
3. Jacqueline B, Michel W, Martine B, et al. Bivalent metal salts of 2-N,N-d i（carboxymethyl）amino,3-cyano,4-carboxymethyl,5-carboxy-thiophene-acid,process for their preparation and pharmacy.EP-0415850.1992
4. Ebetino F, Bayless A, Amburgey J, etal. Elucidation of a pharmacophore for the bisphosphonate mechanism ofbone resorptive activity. Phosphorus Sulfur Silicon 1996,109-110:217-20.
5.Dahl SG, Allain P, Marie PJ, et al: Incoporation and distribution of strontium in bone. Bone, 2001, 28:446-453