螺内酯对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞P-p38MAPK和TGF

　　【摘要】目的：研究糖尿病肾病(diabetic nephropath，DN)大鼠肾小球系膜细胞p38丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的表达及螺内酯对其的影响。 方法：以高糖孵育大鼠肾小球系膜细胞(mesangial rell，MC)24 h，用细胞免疫荧光法检测MC的磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)活性，并用ELISA检测转化生长因子-β1(TGF-β1)分泌状况。p38MAPK特异性抑制剂SB203580及不同浓度螺内酯预处理对其影响。结果：高糖激活p38MAPK，增加RMC的P-p38MAPK活性和TGF-β1的表达;SB203580显著抑制TGF-β1表达(P<0.01);螺内酯抑制P-p38MAPK的活化并减少TGF-β1的蛋白表达(P<0.01)，并随浓度增高，抑制作用增强。结论：p38MAPK可能是糖尿病肾病发生的始动信号之一，螺内酯可能通过抑制p38MAPK磷酸化而减少TGF-β1分泌。

　　【关键词】 糖尿病肾病;螺内酯;磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶;转化生长因子-β1;大鼠

　　[Abstract] Objective: To explore the effect of p38MAPK on diabetic nephropathy (DN) and the effect of spironolactone in rat. Methods: Rat mesangial cells(MC) were incubated with high glucose， after pre-treatment of SB203580 (p38MAPK special inhibitor) and spironolactone, the activity of P-p38MAPK was measured by immunofluorescence and TGF-β1 was examined by ELISA. Results: Compared with that of the control group, high glucose significantly activated p38MAPK and increased the activity of P-p38MAPK and the protein expression of TGF-β1 (P<0.01). The protein expression of TGF-β1 was significantly inhibited by SB203580 (P<0.01). Compared with those in MC incubated with high glucose, P-p38MAPK and TGF-β1 were expressed at a lower level in MC pre-treated with spironolactone (P<0.01). Spironolactone also decreased the P-p38MAPK and TGF-β1 expressions in MC at high glucose concentration in dose-dependent manner. Conclusion: p38MAPK may be one of the initial onset signals of diabetic nephropathy. Spironolactone may effectively attenuate DN progression through downregulating the expression of TGF-β1 via p38MAPK.

　　[Key words] Diabetic nephropathy; Spironolactone P-p38 mitogen-activated protein kinase; Transforming growth factor-β1; Rat

　　目前糖尿病发病有逐年增高趋势，糖尿病对肾脏影响也增多。糖尿病对肾脏的影响及预防治疗国内外均有较多研究，目前仍无有效措施可完全逆转糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的进展与恶化。高糖作用于大鼠肾小球系膜细胞的实验模型在DN的实验中普遍采用，以各作用机制进行了研究阐述，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信号通路是其中作用机制之一。在肾素-血管紧张素-醛固酮系统中，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对肾脏的保护作用已得到人们的公认，但对醛固酮研究较少。本研究拟通过高糖刺激大鼠系膜细胞(mesangial cell，MC)生长，观察系膜细胞增殖及P-p38MAPK活性，检测转化生长因子-β1(tranforming goowth factor-β1，TGF-β1)分泌状况，并用醛固酮抑制剂螺内酯干预后对其产生的影响，以进一步探讨DN发病机制，为防治DN提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　大鼠MC(上海长征医院肾内科)。低糖、高糖DMEM培养液，双抗(Gibco公司)。胎牛血清(杭州四季青公司)。0.25%胰蛋白酶， 24孔培养板(碧云天公司)。螺内酯，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)。噻唑蓝(MTT)(Amresco公司)。兔抗P-p38 MAPK单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，PE标记的鸡抗兔IgG(博士德公司)。 ELISA试剂盒(博士德公司)。酶标仪(Thermo MK3)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 大鼠MC培养

　　常规培养在含10% 胎牛血清的低糖DMEM培养液中， 置37 ℃， 5%CO2 孵箱中培养。每2～3 d 传代1次。取对数生长期MC，接种于24孔板(2×105/ml) 每孔1 000 μl用于检测基质，24 h后换无血清DMEM培养液，37 ℃再孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期。分组(1) 低糖组(LG) :糖浓度5.5 mmol/L DMEM 培养液;(2) 高糖组(HG):糖浓度25 mmol/L DMEM培养液;(3) 高葡萄糖25 mmol/L加SB203580 (10 μmol/L); (4)高葡萄糖25 mmol/L加不同浓度螺内酯组：在高糖DMEM 培养液中分别加入螺内酯浓度0.25 μmol/L(SPI1)， 2.5 μmol/L(SPI2)， 25 μmol/L(SPI3)， 50 μmol/L(SPI4)，每组设6个复孔。

　　1.2.2 细胞免疫荧光法检测MC的P-p38MAPK活性

　　系膜细胞种板分组后，作用24 h后用细胞免疫荧光染色测定P-p38MAPK 的表达:将培养了24 h 的细胞爬片放入4 %多聚甲醛中固定;0.1 %Triton X-100 PBS 4 ℃作用细胞;将兔抗P-p38 MAPK单克隆抗体滴加于细胞爬片，抗体工作浓度为1∶100， 37 ℃作用60 min ，再放入4 ℃湿盒内过夜; PE标记的鸡抗兔IgG滴加于细胞爬片，抗体工作浓度为1∶50， 37 ℃作用60 min;用荧光显微镜观察细胞的荧光分布及强度。每步之间用PBS 缓冲液充分冲洗。测定时选用荧光显微镜激发光波长为493 nm，525 nm蓝色滤光片观察，200倍镜下随机取5个视野，每个视野计数100个细胞，测量阳性细胞所占比例。

　　1.2.3 细胞上清液TGF-β1检测

　　取于24孔板培养MC　24 h后应用ELISA方法检测不同浓度螺内酯作用细胞上清液中的TGF-β1含量。过程严格按ELISA试剂盒操作说明进行。

　　1.3 统计学方法

　　所有数据用s表示，用Stata7.0软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 螺内酯对高糖培养的MC P-p38MAPK活性的影响

　　与低糖组相比高糖组P-p38MAPK活化率明显升高。高糖环境下给予p38MAPK特异性抑制剂SB203580 (10 μmol/L)处理，P-p38MAPK的活化率明显降低，差异有统计学意义。在不同浓度螺内酯处理后P-p38MAPK的活化率与高糖组比较明显降低，且活化率呈浓度依赖性降低见表1。

　　2.2 螺内酯对高糖诱导MC分泌TGF-β1的影响

　　MC单纯经高糖处理后， TGF-β1含量均较对照组明显增加; SB203580处理TGF-β1量则均较单纯高糖处理组下降;而同时加入螺内酯后， TGF-β1量则均较单纯高糖处理组下降，且随螺内酯浓度升高抑制作用增强见表2。

　　3 讨 论

　　丝裂原活化的蛋白激酶是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞将胞外信号转导至核内的重要信号传导系统[1]。MAPK家族主要包括胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK mitogen-activated protein kinases，JNK)以及p38MAPK。其中p38MAPK信号通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种生理过程，并可调节IL-6、TNF-α、TGF-β1等细胞因子的表达，介导炎症、应激等多种细胞反应，被认为参与了炎症和纤维化过程[2]。鉴于p38MAPK重要的病理生理作用，其在DN中的作用也开始受到关注。实验结果显示抑制p38MAPK信号通路可减少纤维连接蛋白的表达，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的产生等作用而对DN的发展产生有益作用[3-4]。因此阻断MAPK通路对DN的预防和治疗具有重要意义。动物实验中，肾脏转染TGF-β1的cDNA可导致肾小球硬化[5]。DN中TGF-β1的特征性作用是刺激系膜区基质沉积， 纤维黏连蛋白(fibronectin，FN)作为细胞外基质的主要成分之一，主要是由TGF-β1 激活，但对TGF-β1调节纤维连接蛋白基因表达的信号转导通路仍知之甚少，与基质沉积有关的一系列基因及产物，对TGF-β1的应答受不同信号转导的调节。研究揭示[6] MAPK通路可介导TGF-β1 诱生的系膜区基质沉积。另一方面TGF-β1又可通过p38MAPK 发挥作用，TGF-β1 可以活化p38MAPK，可以使成纤维细胞纤维连接蛋白表达增加，p38MAPK的抑制剂可以取消这种效应[7]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统与DN的发生有密切关系，在肾脏纤维化中起着重要作用，既往认为AngⅡ是这一系统中造成肾脏损害的主要物质，早期研究显示长期使用ACEI的患者存在醛固酮的“逃逸”现象[8]，醛固酮受体拮抗剂螺内酯(安体舒通)，其化学结构与醛固酮类似，是醛固酮的竞争性抑制剂，有较弱利尿作用。在实验性环胞霉素A的肾毒性中发现螺内酯能下调TGF-β1，减少Ⅰ型胶原的沉积和FN的分泌，减轻了小管间质纤维化[9-10]。

　　本研究显示，高糖环境下P-p38MAPK的活化率明显升高，说明p38MAPK在DN发病中起重要作用。经p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理，P-p38MAPK的活化率明显降低，螺内酯有类似作用，说明螺内酯有抑制p38MAPK的作用，且随浓度增强抑制作用增强。螺内酯抑制p38MAPK作用较SB203580弱，提示可螺内酯部分抑制p38MAPK。高糖环境下TGF-β1分泌增多，经p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理，TGF-β1分泌减少，说明TGF-β1可能受p38MAPK调控。而螺内酯作用下TGF-β1分泌减少，且随浓度增强抑制作用增强。提示螺内酯可以抑制TGF-β1分泌。p38MAPK可能是DN发生的始动信号之一，螺内酯可能通过抑制p38MAPK磷酸化而减少TGF-β1分泌。

　　【参考文献】

　　[1] Stambe C, Atkins RC, Tesch GH, et al. The role of p38α mitogen-activated protein kinase activation in renal fibrosis[J]. J Am Soc Nephrol, 2004, 15(2):370-379.

　　[2] Sakai N, Wada T, Furuichi K, et al. Involvement of extracellular signal-regulated kinase and p38 in human diabetic nephropathy[J]. Am J Kidney Dis, 2005, 45(1):54-65.

　　[3] Jung DS, Li JJ, Kwak SJ, et al. FR167653 inhibits fibronectin expression and apoptosis in diabetic glomeruli and in high-glucose-stimulated mesangial cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 295(2):F595-E604.

　　[4] Uriuhara A, Miyata S, Liu BF, et al. Methylglyoxal induces prostaglandin E2 production in rat mesangial cells[J]. Kobe J Med Sci, 2007, 53(6):305-315.

　　[5] Isono M, Mogyorósi A, Han DC, et al. Stimulation of TGF-β type Ⅱ receptor by high glucose in mouse mesangial cells and in diabetic kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2000, 278(5):F830-F838.

　　[6] Lee SJ, Kang JG, Ryu OH, et al. Effects of alpha-lipoic acid on transforming growth factor beta1-p38 mitogen-activated protein kinase- fibronectin pathway in diabetic nephropathy[J]. Metabolism, 2009, 58(5):616-623.

　　[7] Naito T, Masaki T, Nikolic-Paterson DJ, et al. Angiotensin Ⅱ induces thrombospondin-1 production in human mesangial cells via p38 MAPK and JNK:a mechanism for activation of latent TGF-β1[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2004, 286 (2):F278-F287.

　　[8] Borghi C, Boschi S, Ambrosioni E, et al. Evidence of a partial escape of renin-angiotensin-aldosterone blockade in patients with acute myocardial infarction treated with ACE inhibitors[J]. J Clin Pharmacol, 1993, 33(1):40-45.

　　[9] Feria I, Pichardo I, Juarez P, et al. Therapeutic benefit of spironolactone in experimental chronic cyclosporine A nephrotoxicity[J]. Kidney Int, 2003, 63(1):43-52.

　　[10] 陈玉莲, 陈晓岚, 李辉, 等. NS-398通过转化因子-β/Smad信号通路对肾小球系膜细胞环氧化酶-2表达的影响[J]. 南通医学院学报, 2009, 29(2):92-94, 67.