欧前胡素缓释片的制备及家兔血浆动力学研究

　　【摘要】目的制备欧前胡素亲水凝胶缓释骨架片并考察其家兔体内动力学。方法以羟丙基甲基纤维素(HPMC)和卡波姆为二元骨架系统，采用正交设计法优化欧前胡素缓释片。以GCMS方法测定血药浓度，采用单次交叉给药方案，以自制欧前胡素普通片为参照，对欧前胡素缓释片进行了家兔体内药动学的初步研究。结果 欧前胡素缓释片优化处方中骨架缓释材料为HPMC K100M 1∶20，卡波姆 2∶25;单剂量口服300mg 欧前胡素缓释片与参比制剂的AUC分别为(391.08±47.22)和(368.25±136.15)μg/(h·L);tmax为(2.26±0.25)和(0.33±0.05)h;Cmax为(59.66±6.28)和(295.91±127.00)μg/L;T1/2ke为(2.27±0.09)和(0.60±0.10)h。缓释片的相对生物利用度为(115.37±45.46)%。结论 采用二元骨架系统制得的欧前胡素缓释片缓释效果良好。

　　【关键词】 欧前胡素;缓释片;动力学

　　ABSTRACT: Objective To prepare imperatorin sustainedrelease tablets and study their pharmacokinetics and bioavailability in rabbits.Methods Hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) and carbomer were used to constitute the binary polymer matrix. Orthogonal design was used to optimize the formulation of imperatorin sustainedrelease tablets. The preliminary pharmacokinetic study in the rabbits was carried out by singledose crossover design using imperatorin plain tablets as control. An appropriate GCMS method was developed for measuring the concentration of imperatorin in the blood.Results Optimized formulation contained 1∶20 HPMC K100M and 2∶25 carbomer. Single dose test with 300mg showed that the relative bioavailability of imperatorin sustainedrelease tablets was (115.37±45.46)%; AUC of the studied tablets and control tablets was (391.08±47.22) and (368.25±136.15)μg/(h·L), tmax (2.26±0.25) and (0.33±0.05)h, Cmax (59.66±6.28) and (295.91±127.00)μg/L, T1/2ke (2.27±0.09) and (0.60±0.10)h, respectively.Conclusion The release behavior of the imperatorin sustainedrelease tablets prepared with binary polymer system shows evident sustainedrelease characteristics.

　　KEY WORDS: imperatorin; sustainedrelease tablet; pharmacokinetics

　　欧前胡素(imperatorin)是从白芷、蛇床子等中药中提取出的具有镇痛、抗炎、抗肿瘤作用功效的活性成分[16]。研究表明欧前胡素具有诱导血管舒张的作用，其机制可能为抑制电压依赖性钙通道的开放并且抑制受体介导的钙离子内流和释放[7]。本实验室研究结果表明欧前胡素能明显抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移。提示欧前胡素能够抑制血管壁增厚，从而对高血压、动脉粥样硬化等疾病有治疗作用，为欧前胡素研发成为有效的抗高血压药物提供了重要的理论依据。欧前胡素原料药小鼠体内药动学研究表明其生物半衰期短，在体内达到血药浓度高峰后迅速消除[8]。由于高血压患者需长期服药，为了减少患者服药次数，提高服药顺应性[9]，本实验将欧前胡素制备成缓释制剂。

　　前期研究表明单独使用任一种所选的缓释材料都不能得到理想的释药曲线，而使用羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose, HPMC)和卡波姆组成二元骨架系统，能很好的控制药物的释放[10]。实验采用正交设计方法优化了欧前胡素缓释片处方组成;并对优化出的欧前胡素缓释片进行了家兔体内药动学及生物利用度的初步研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂与仪器 欧前胡素原料药由实验室自制，高效液相色谱法测定含量在98%以上;欧前胡素对照品，批号为110826200511，购自中国药品生物制品检定所;蛇床子素对照品批号为110822200305，购自中国药品生物制品检定所;羟丙基甲基纤维素购自美国卡乐康公司;卡波姆934NF购自美国诺誉化工;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)购自西安富力化工厂，进口分装;岛津高效液相色谱系统(SPD10Avp紫外可见光检测器，LC10ATvp色谱泵)购自日本岛津公司;GCMSQP2010 PLUS气相质谱仪购自日本岛津公司;RC8D溶出度测试仪购自天津市国铭医药设备有限公司;DP/30A单冲压片机购自北京国药龙立科技有限公司;SK1型快速混匀器系广州市富城仪器厂生产;TDL802B台式离心机由上海安亭科学仪器厂生产。

　　1.2 实验动物 家兔6只，雄性，体重1.9～2.1kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.3 缓释片的制备 将欧前胡素原料药、辅料过80目筛，取处方量的原料药与HPMC混合均匀，加入质量比为3∶20 PVP的乙醇溶液制软材，过24目筛制颗粒，将湿颗粒在60℃干燥2h，24目筛整粒，将干颗粒与处方量的卡波姆、硬脂酸镁混匀，压片。片重0.3g(每片含主药40mg)。

　　1.4 处方优化 在单因素试验及文献的基础上，对欧前胡素缓释片释放行为影响较大的因素卡波姆用量、HPMC的用量、HPMC规格进行处方正交设计优选。采用三因素三水平L9(34)正交设计，考察因素变化对药物释放的影响。三水平分别设置为：卡波姆用量1∶20、2∶25、1∶10;HPMC用量1∶20、2∶25、1∶10;HPMC规格K4M、K15M、K100M。以主要时间点的药物释放度为评测指标，选定最优处方。对释放度重点考察三个时间点的累积释放度。理论累积释放度应为3h为20%～40%;6h为50%～70%;12h为80%～100%。根据评分标准Y=|P3-30%|×1+|P6-60%|×1+|P12-90%|×1，P3、P6、P12分别代表3、6、12h时药物释放累积百分率。对释放度进行评分，Y为得分数，Y值越小，得分越低，表明药物释放行为与预先设定的释放标准越接近。

　　1.5 体外释放度的测定 采用中国药典(2005版)附录XC第二法测定。量取经脱气处理的释放介质含1∶200十二烷基磺酸钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)900mL，置溶出杯内，同时在溶出杯内放入自制的2cm×2cm的铁丝编制的网格并加温，待释放介质温度恒定在(37±0.5)℃，转速为每分钟100转，待其平稳后，取欧前胡素缓释片6片，分别投入6个溶出杯内，放置在事先放入的铁丝网格上，至1、2、3、4、6、8、10、12h吸取溶出液0.5mL，立即补加等温释放介质，将取出的溶出液经0.45μm微孔滤膜滤过后，取续滤液10μL进样，高效液相色谱法分析，按外标法计算欧前胡素的浓度，并计算累积溶出百分率。以累积溶出百分率对时间作图，得溶出曲线。

　　色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm);流动相：甲醇∶水(65∶35);检测波长302nm;柱温：25℃;流速：1.0mL/min理论塔板数以欧前胡素峰计应不低于3000。

　　1.6 药动学研究 给药方案及血样采集。健康家兔6只，服药前禁食12h，随机分成两组，一组先口服欧前胡素缓释片1片(每片含欧前胡素40mg)，后口服欧前胡素普通片2片(每片含欧前胡素20mg);另一组先口服欧前胡素普通片2片，后口服欧前胡素缓释片1片，两次服药间隔7d。给药前先取血作为空白对照，给药后普通片于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12h;缓释片于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12h在兔耳缘静脉处采血约0.8mL，置于涂有肝素的离心试管中，立即于3000r/min条件下，离心10min，吸取上层血浆，置于-20℃冰箱中保存，待分析。

　　血浆药物浓度的测定采用GCMS联用分析方法。色谱条件：气相条件为Rtx5MS(30m×

　　0.25mm×0.25μm)毛细管气相色谱柱;以高纯氦气为载气，流速2.0mL/min;进样口温度：280℃，进样方式：不分流进样，程序升温：起始温度140℃，保持2min，以10℃/min速率升温至280℃，保持4min，进样为1μL，接口温度280℃。质谱条件为EI源温度200℃，电子轰击能量为70eV，分时段选择离子检测，测定欧前胡素时，3min到12min时选择质荷比为244，12min到20min时选择质荷比为202。

　　2 结 果

　　2.1 正交试验结果 根据各处方不同时间的累积释放百分度及评分标准，计算各处方的Y值，并对试验结果进行综合分析(表1);采用SPSS软件对正交试验结果进行方差分析(表2)。表1 欧前胡素缓释片释药行为影响因素的考察表2 影响因素的方差的比较

　　由正交实验结果得到因素对指标的影响大小依次为HPMC规格>HPMC用量>卡波姆用量，各因素间最佳水平：卡波姆用量2∶25>1∶20>1∶10;HPMC用量1∶20>1∶10>2∶25;HPMC规格K4M>K15M>K100M。最佳处方为A2B1C3。即缓释材料组成为含卡波姆2∶25，HPMC(K100M)1∶20。方差分析结果表明：C因素影响具有统计学意义。

　　依最佳处方制备欧前胡素缓释片进行溶出实验(图1)，结果表明，优化出的欧前胡素缓释片体外

　　0～12h累积释放百分率与时间t的关系符合一级动力学方程y=-0.211x+0.2538(r=0.9939)，在3个主要时间点的释药量与理论值接近，分别为29.13%、62.32%、88.69%。

　　3.2 欧前胡素缓释片家兔血浆动力学

　　3.2.1 方法的专属性 在“1.6”色谱条件下，空白对照血浆样品几乎无干扰峰出现，欧前胡素的保留时间约为13.5min，内标(蛇床子素)的保留时间约为

　　11.5min，两者达到了完全分离且血浆中内源性物质对欧前胡素的分析没有干扰(图2)。

　　A：空白对照血浆;B：空白对照血浆加入欧前胡素对照品和内标(蛇床子素);C：血浆样品;1：蛇床子素;2：欧前胡素。

　　3.2.2 标准曲线 欧前胡素在0.001～5.0mg/L内呈良好的线性，标准曲线方程为y=0.3841x-0.0006(r=0.9995)。

　　3.2.3 方法精密度和回收率 欧前胡素高、中、低3个浓度质量控制样品的日内日间精密度分别为1.2%、4.9%、3.9%及3.9%、2.8%、4.4%;方法回收率相对标准偏差分别为8.1%、2.5%、9.2%;提取回收率为80.3%～83.3%，相对偏差<10%(n=5)。结果表明，方法适于欧前胡素体内药物浓度的测定。

　　3.2.4 血药浓度时间曲线及主要药动学参数 以时间为横坐标，浓度为纵坐标绘制欧前胡素缓释片及其参比制剂在家兔体内的血药浓度时间曲线(图3)。采用3P97药动学程序以一室模型对欧前胡素血药浓度时间数据进行了处理(表3)，权重为1/C。表3 欧前胡素缓释片及其参比制剂在家兔体内主要药动学参数

　　由以上药时曲线及部分药动学参数可以看出，普通片吸收快，tmax为0.33h，Cmax为295.91μg/L，消除半衰期较短仅约0.6h。普通片药时曲线显示有一明显尖锐的峰，而缓释片药时曲线并无明显的峰谷现象，显著推迟了达峰时间，降低了峰浓度(P<0.05)。两制剂的血浆动力学曲线下面积[11](AUC0→∞)无显著性差异(P>0.05)。以上实验说明与普通片相比，缓释片血药浓度能在一段较长时间内维持在一个相对平稳的水平，达到了血药浓度平缓、持久的目的。

　　3 讨 论

　　欧前胡素为水难溶性的药物，制成的骨架缓释片主要是以溶蚀机制为主。在预实验中，单独使用了不同型号的HPMC(K4M、K15M、K100M)，卡波姆、 羧甲基纤维素钠、PVP以不同的含量(与药片质量比为1∶10、1∶5、3∶10)为缓释材料。但是，实验结果表明单独使用一种缓释材料不能很好的控制欧前胡素12h的有效释放。药物或者释放偏快，或者释放不完全。为解决此问题，将两种缓释材料联合应用，即使用HPMC与卡波姆联合应用，并通过正交实验设计优选出了最佳处方。最佳处方的体外药物释放基本符合预先设定的理论释放度的标准。

　　本实验采用灵敏度高的GCMS测定方法，建立了适用于欧前胡素药动学研究的分析方法。家兔分别口服普通制剂和缓释制剂，结果缓释制剂在兔体内达峰浓度较低，达峰时间延迟且吸收较普通制剂缓慢，生物利用度与普通制剂无显著性差异。此缓释制剂在比格犬体内的药动学正在研究中，而是否在人体内有相同的缓释效果还有待进一步的药物动力学研究。

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