重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶转染大鼠耳蜗血管纹缘细胞的研究

　　【摘要】 目的　探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes 2，rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells， MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，MnSOD)，获得高表达MnSOD转基因缘细胞的可行性。方法　实验组按感染复数(MOI)为104 v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2- MnSOD-EGFP，同时设转染rAAV2-EGFP缘细胞作为空载对照组,未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白(Enhenced green fluorescent protein, EGFP)表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2- MnSOD-EGFP后MnSOD的表达，免疫印迹法(Western blot)定量分析MnSOD的表达。结果　(1) 各组MCs转染后,生长正常, 空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达，1周后至高峰;实验组转染rAAV2- MnSOD-EGFP后4 d出现EGFP的表达，10 d至高峰，且持续表达于细胞培养的整个期间。EGFP的表达在荧光显微镜490 nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质。(2)对激光共聚焦显微镜及Western blot的检测结果进行分析，实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高，差异有统计学意义。结论　rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。

　　【关键词】 血管纹

　　Recombinant adeno-associated virus serotypes 2 mediated delivery and expression of MnSOD in cultured strial marginal cells

　　LI Jun, YANG Yang, KONG Wei-jia, HU Yu-juan

　　Department of Otorhinolaryngology, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong

　　Universty of Science & Technology, Wuhan, 400022, China

　　【Abstract】 Objective　To obtain transgenic marginal cells (MCs) of the rat cochlea stria vascularis by recombinant adeno-associated virus serotypes 2(AAV2) mediated delivery of cDNA of manganese superoxide dismutase (MnSOD). Methods　Cultured rat MCs were infected with rAAV2-MnSOD-EGFP at dosage of multiplicity of infection(MOI) 104 v.g. /cell and with rAAV2-EGFP as control. The expression of EGFP in MCs was examined using a fluorescence microscope every 2 days after infection. The activity of MnSOD was determined by colorimetric assays. The expression of MnSOD in MCs was examined using western blot and laser scanning confocal microscopy. Results　(1)The expression of EGFP in MCs could not be detected until 2 days after rAAV2-EGFP infection and until 4 days after rAAV2-MnSOD-EGFP infection. The positive expression of EGFP in MCs reached fastigium after a week and lasted over a month. (2) According to the results of western blot test and the laser scanning confocal microscopic examination, the concentration of MnSOD in the MCs after rAAV2-MnSOD-EGFP infection was higher than that in the control cells. Conclusion　The rAAV2-MnSOD-EGFP can effectively transfect cultured MCs, and the

　　transgenic cells show a high expression of MnSOD.

　　【Key words】　Stria vascularis;　Marginal cells;　Adeno-associated virus;　Manganese superoxide dismutase;　Transgene

　　耳蜗血管纹缘细胞对维持耳蜗内淋巴液高渗透压、高钾、高蜗内电位的特殊电化学特征，提供耳蜗毛细胞进行机械-电信号转导必需的电化学梯度有重要意义。缘细胞的损伤、变性及死亡将影响毛细胞的代谢和功能,导致听功能异常和听力下降。近年来有研究表明,药物性耳聋、噪声性聋、老年性聋及梅尼埃病均与缘细胞氧化损伤有关[1-4]。如何提高缘细胞的抗氧化能力以有效地干预内耳的氧化损伤是目前耳科学者关注的焦点。锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，MnSOD)为细胞内重要的自由基(Reactive oxygen species，ROS)清除剂，如果将MnSOD基因导入缘细胞产生持续高表达,则有可能获得更有效的抗氧化能力。腺相关病毒(Adeno-associated viruses，AAV)是一种复制缺陷型病毒, 据报道是目前唯一没有引起人类宿主任何病理反应的病毒载体[5， 6]。耳科学者也相继报道了AAV应用于内耳转染的研究[7-9]，但目前尚未见重组2型腺相关病毒(The recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2， rAAV2)应用于MnSOD基因转导缘细胞的报道。为此, 本研究观察rAAV2载体携带MnSOD基因对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells，MCs)的转染及转染后MnSOD的表达情况，为进一步研究缘细胞氧化损伤机制及干预奠定基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　血管纹缘细胞的体外培养及鉴定

　　取0 ~ 3天新生的Wister大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)，75% 酒精浸泡5分钟，断头，取出双侧听泡浸入D-Hanks液(含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素)中冲洗5分钟，再置入新鲜的D-Hanks液中。解剖显微镜下去除听泡骨壳，分离耳蜗外侧壁组织，自基底回至顶回将血管纹剥离并将其切碎成0.5 mm大小的微小组织块(7 ~ 10块/耳蜗)，加入0.5 ml 0.1% 胶原酶Ⅱ(美国Sigma公司)37℃ 消化30 min，离心800 ~ 1 000转每分5 min，弃上清，再加入1 ml无血清MEM-α培养液(Hyclone，含L-谷氨酰胺　2.0 mmol /L，Hepes 20 mmol /L，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)吹打。将细胞悬液接种于6孔培养板的一个孔(用无血清培养基)静止20 min，然后将培养液连同尚未贴壁的细胞一起吸到培养板的另一个孔，静止20 min后再吸出未贴壁细胞接种于第三孔并加入含有10%胎牛血清(GIBCO，USA)的MEM-α培养液，置5% CO2、37℃ 培养箱中继续培养，24小时后可见细胞贴壁,以后每周换液两次。待细胞长满后，将0.1% 胰蛋白酶(美国Sigma公司)注入培养板孔内在倒置显微镜下观察，稍加摇动，可见纤维样细胞变圆，部分脱壁。立即加入有血清培养液终止消化轻轻吹打，吸出脱壁细胞加入1ml培养液继续培养，如此反复使用上述方法纯化。缘细胞的鉴定参照文献[10]。

　　1.2　rAAV2-MnSOD-EGFP(rAAV2-MnSOD-绿荧光蛋白)转染体外培养的MCs

　　取90% 融合的纯化后MCs，按常规细胞传代培养将细胞接种至24孔板，细胞接种浓度为 104个/ml，每个培养皿接种0.5ml细胞悬液。常　规MCs贴壁培养24h后，按感染复数(MOI)为　104 v.g. /cell的剂量，实验组加入用Opti-MEM培养基(美国Invitrogen公司)适当稀释的rAAV2-MnSOD-EGFP(本实验室杨阳博士提供)，使其恰好完全覆盖细胞培养面积，置入5%CO2、37℃ 培养箱孵育，每隔30 min振摇1次，使rAAV2-MnSOD-EGFP与细胞充分接触，4 ~ 6 h后换含有10% 胎牛血清完全培养基继续按常规贴壁细胞进行培养，每3 d换液1次，荧光显微镜(日本Olympus公司)490 nm波长激发光下观察MCs的EGFP表达情况。同法转染rAAV2-EGFP(本元正阳基因技术有限公司)作为空载对照组。未转染细胞作为空白对照组。

　　1.3　缘细胞MnSOD活性的检测

　　胰蛋白酶消化、收集实验组、空载对照组和空白对照组细胞，冰上超声破碎。按测分型SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明操作，比色法测定MnSOD活性。

　　1.4　激光共聚焦显微镜观察MnSOD的表达

　　将纯化后的MCs按常规细胞传代培养接种至多聚赖氨酸包被的玻片上，细胞接种密度为104个/ml,分三组，其中两组按上述方法分别进行rAAV2- MnSOD-EGFP和rAAV2-EGFP转染。待细胞表达EGFP后， 4%多聚甲醛固定， 0.3% Triton-100破膜， 5% BSA(牛血清白蛋白)封闭， MnSOD多克隆抗体(CHEMICON，美国) 4℃ 过夜，罗丹明标记的二抗(晶美生物公司)37℃ 孵育40 min，50% 甘油封片，激光共聚焦显微镜观察，拍照。

　　1.5　Western blot(免疫印迹法)分析MnSOD的表达

　　胰蛋白酶消化、收集各组细胞，用RIPA(含PMSF蛋白酶抑制剂)细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定蛋白浓度，蛋白变性上样10 ?滋g/孔， 行15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳,转PVDF(polyvinylidene difluoride)膜，用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加MnSOD多克隆抗体(CHEMICON，美国)(1∶1000)，4℃ 过夜，TBST洗涤3次(10 min/次)，二抗(1 ∶ 5000，晶美生物公司)室温2 h，洗涤3次，每次10 min，使用ECL-Plus检测套包(美国Pierce公司)显影、定影，Kodak 4000MM照相。同时用β-actin抗体检测显影作为内参照。用Gel-Pro analyzer软件分析显影条带的灰度值，计算灰度值MnSOD/灰度值　β-actin比值A;以此作为各组MnSOD蛋白的相对表达量做统计分析。

　　1.6　统计学处理

　　实验数据采用SPSS 12.0软件t检验进行统计学分析，所有数据结果以x ± s表示，P < 0.05为有统计学意义

　　2　结　果

　　2.1　体外培养的血管纹缘细胞的形态学观察

　　培养24h后，倒置显微镜下可见多边形细胞贴壁，72h后细胞增殖团融合形成上皮单层，呈“舖路石样”，并可见由数百个MC密集生长组成的折光性强的球形结构(dome)。原代细胞培养生长旺盛时进行传代纯化，经差异性贴壁和选择性消化后细胞纯化可达95% 以上，纯化后单个MC呈不规则多角形，细胞增殖相互连接紧密排列呈现培养上皮细胞典型的“铺路石”，第5代左右细胞开始老化，不再增殖，胞浆出现空泡，细胞骨架明显。转染液作用于细胞后4 ～ 6h，可见部分细胞出现皱缩，更换培养基继续培养后细胞形态恢复正常。

　　2.2　血管纹缘细胞的体外转染

　　各组MCs转染后，细胞形态较好，未见变圆和凋亡。实验组转染rAAV2- MnSOD-EGFP4d后出现微弱的EGFP表达，连续观察发现随着时间延长,EGFP阳性细胞逐渐增多，荧光亮度增强，到第10天时至高峰，表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化;空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP 2天后开始出现EGFP的表达，1周达高峰，EGFP阳性细胞可达40%。观察至一月转染组细胞仍可见EGFP的表达。EGFP的表达在荧光显微镜490 nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质。空白对照组未见绿色荧光。

　　2.3　缘细胞MnSOD活性的检测

　　血管纹缘细胞胞浆内MnSOD活性(14.28 ±8.19 U/mgprot)在转染rAAV2- MnSOD-EGFP后明显升高，与空载对照组(6.02 ± 5.01 U/mgprot)和空白对照组(7.17 ± 5.70 U/mgprot)相比差异有显著性(P < 0.05);而空载对照组与空白对照组相比差异无显著性(P > 0. 05)(图1)。

　　2.4　激光共聚焦显微镜观察缘细胞MnSOD的表达

　　激光共聚焦显微镜下见转染rAAV2- MnSOD-EGFP的实验组中表达绿色荧光阳性的细胞，其罗丹明标记MnSOD的红色荧光增强(图2A);而转染rAAV2-EGFP的空载对照组绿色荧光表达阳性的细胞，其罗丹明标记MnSOD的红色荧光无增强(图2B)。空白对照组细胞均未见绿色荧光，仅见较为均一的红色荧光(图2C)。

　　2.5　Western blot 分析缘细胞MnSOD的表达

　　免疫印迹法检测结果显示，在空载对照组、空白对照组和实验组均可见MnSOD蛋白的显影条带，但实验组明显强于空载对照组和空白对照组;内参照β-actin蛋白在各组的显影条带较为一致(图3)。

　　计算实验组、空载对照组和空白对照组灰度值MnSOD/灰度值β-actin的比值A，分别为1.434 ± 0.100、0.921 ± 0.147和0.967 ± 0.124。统计学分析显示实验组与空载对照组和空白对照组相比差异有显著性(P < 0.05)， 空载对照组与空白对照组相比差异无显著性(P > 0.05)(图4)。

　　3　讨　论

　　耳蜗解剖结构复杂，由于血-迷路屏障的作用,常规口服及胃肠道外给药难以达到耳蜗局部;而局部直接给药的操作复杂，难以长期反复进行，临床应用有限。采取何种有效方法治疗内耳疾病一直为耳科学者关注，目前以核酸转染技术为基础的基因治疗已经成为许多学者探索治疗耳疾病的研究重点。本研究通过转染体外培养的MCs动态观察了rAAV2对MCs感染的生物学特性。虽然在病毒感染液孵育缘细胞的最初4 ~ 6小时，有一部分细胞出现皱缩，但24小时后细胞形态恢复，未见凋亡和坏死，传代细胞增殖正常，可见rAAV2载体的细胞毒性低。细胞转染后, rAAV2所携带的目的基因经过约2d的潜伏期后可以出现表达，5 ~ 7d后目的基因的表达进入高峰,即rAAV2转染MCs后目的基因的表达潜伏期大约是3 ~ 7d;荧光显微镜下见EGFP阳性细胞可达40%，表明rAAV2病毒载体可有效地感染体外培养的MCs。观察至一个月时，转染组的细胞仍可见EGFP的表达，rAAV2载体介导的目的基因在MCs中表达稳定。AAV对　细胞的感染是由靶细胞膜上存在的AAV受体介导　的[11-13]，不同血清型AAV的转染效率与细胞种类有关。目前, 所公认AAV血清型已有十一种，其中以AAV2的研究最为广泛，现已见 AAV2可转染耳蜗毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞和螺旋韧带细胞的报道[9]，本研究结果显示rAAV2载体亦可转染耳蜗血管纹缘细胞，为今后耳蜗基因转染的载体选择提供参考。

　　本研究中rAAV2转染MnSOD基因的同时携带EGFP基因，Western blot 分析结果显示，经rAAV2- MnSOD-EGFP感染的实验组缘细胞MnSOD表达明显高于空载对照组和空白对照组，细胞免疫荧光检测中实验组MCs表达绿色荧光阳性的细胞其罗丹明标记MnSOD的红色荧光增强(图2A)。以上结果表明rAAV2载体能携带目的基因进入胞核进行基因转录进而翻译和有效地合成目的蛋白，并且携带MnSOD与EGFP两个目的基因共表达(图2A)。虽然rAAV2载体系统能携带不同目的基因转染MCs并共表达，但观察到实验组细胞EGFP表达迟于空载对照组且荧光较弱，阳性细胞率降低(图2)，考虑这是rAAV2-MnSOD-EGFP中基因启动子下游紧邻的是MnSOD基因，而EGFP基因位于MnSOD基因之后，启动子激活后首先表达MnSOD，后表达绿色荧光蛋白的结果。细胞免疫荧光检测中转染rAAV2-EGFP的空载对照组MCs绿色荧光表达的强弱与罗丹明标记MnSOD的红色荧光的强弱无一致性(图2B)，可排除荧光间相互干扰产生的假阳性。同时，比较空载对照组与空白对照组的MnSOD活性和表达，其差异无显著性，可见rAAV2载体对缘细胞自身基因组的表达及蛋白活性无干扰，是一种安全的病毒载体。

　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SODs)是体内抗氧化防御系统的第一道防线[14]，从结构上可分为两族: Cu/ZnSOD和MnSOD。其中MnSOD紧靠线粒体电子传递链,主要催化超氧阴离子(superoxide anion radicals)形成过氧化氢，清除线粒体中的ROS，在体内外抗氧化损伤中发挥重要作用[15]。Kawamoto[16]等将带有Cu/ZnSOD和MnSOD的基因导入豚鼠耳蜗，发现能部分对抗氨基糖甙类药物的毒性，且 MnSOD起主导作用。XIE[17]等观察过氧化氢对体外培养的新生鼠螺旋神经节细胞的氧化损伤中发现MnSOD有拮抗作用。MnSOD水平的调节可能是细胞所有氧化还原状态的重要生理机制[16]。细胞免疫荧光结果可见rAAV2-MnSOD-EGFP感染缘细胞后胞浆MnSOD的表达增强(图2A)，胞浆线粒体电子传递链为细胞中ROS产生的重要场所，过多的ROS导致线粒体代谢及氧化还原状态混乱进而导致细胞受损，rAAV2介导耳蜗血管纹缘细胞MnSOD高表达是否能有效拮抗氧化损伤及其机制有待进一步研究。

　　本研究结果表明rAAV2是一种安全、稳定的基因转染载体，其介导锰超氧化物歧化酶基因能有效转染耳蜗血管纹缘细胞，并获得持续、高效的MnSOD表达，为我们研究内耳氧化损伤机制和探讨基因治疗提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　1　Shi X, Nuttall AL. Upregulated iNOS and oxidative damage to the cochlear stria vascularis due to noise stress. Brain Res, 2003, 967(1-2): 1-10.

　　2　Labbé D, Teranishi MA, Hess A, et al. Activation of caspase-3 is associated with oxidative stress in the hydropic guinea pig cochlea. Hear Res, 2005, 202(1-2): 21-27.

　　3　Sill AM, Stick MJ, Prenger VL, et al. Genetic epidemiologic study of hearing loss in an adult population. Am J Med Genet, 1994, 54(2):149-153.

　　4　Spicer SS, Schulte BA. Pathologic changes of presbycusis begin in secondary processes and spread to primary processes of strial marginal cells. Hear Res, 2005, 205(1-2): 225-240.

　　5　Daly TM. Overview of adeno-associated viral vectors. Methods Mol Biol, 2004, 246: 157-165.

　　6　Flotte TR.Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus(rAAV) vectors. Gene Ther, 2004, 11(10): 805-810.

　　7　Lalwani AK, Walsh BJ, Reilly PG, et al. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther, 1996, 3(7):588-592.

　　8　Lalwani AK, Walsh BJ, Carvalho GJ, et al. Expression of adeno-associated virus integrated transgene within the mammalian vestibular organs. Am J Otol 1998, 19(3): 390-395.

　　9　刘玉和.腺相关病毒载体的制备及其在耳蜗转基因研究中的应用. 中华耳科学杂志, 2006, 4 (4): 343-347.

　　10　李隽， 孔维佳， 陈敏， 等. 成年大鼠耳蜗血管纹缘细胞的体外培养. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007， 21(22): 1031-1033.

　　11　Xiao W, Chirmule N, Berta SC, et al. Gene therapy vectors based on adeno-associated virus type 1. J Virol, 1999，73(5): 3994-4003.

　　12　Handa A, Muramatsu S, Qiu J, et al. Adeno-associated virus (AAV)-3-based vectors transduce haematopoietic cells not susceptible to transduction with AAV-2-based vectors. J Gen Virol， 2000， 81(Pt 8): 2077-2084.