噪声损伤引起耳蜗外毛细胞凋亡时细胞核内单链DNA的产生及EndoG的转移

　　【摘要】 目的　观察噪声损伤后耳蜗外毛细胞内单链DNA和EndoG的变化，探讨耳蜗外毛细胞的死亡机制。方法　豚鼠随机分为噪声暴露组、MNNG耳蜗灌流组和对照组(每组各12只);小鼠随机分为噪声暴露组和对照组(每组12只)。分离解剖耳蜗后，用碘化丙啶(PI)染色细胞核、Pholloidin染色F-actin，免疫荧光抗体分别染色单链DNA(ssDNA)、核酸内切酶G(Endonuclease G EndoG)和凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factors, AIF)，制备耳蜗铺片，激光共聚焦显微镜下观察凋亡和坏死毛细胞内的荧光信号变化。结果　(1)暴露于120 dB SPL的白噪声环境中每天4小时，连续2天后引起豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时，其细胞核内产生ssDNA，而在正常细胞内没有三ssDNA;(2)在正常情况下，EndoG分布于耳蜗毛细胞的细胞核外，在暴露于上述噪声后发生凋亡和坏死的豚鼠耳蜗外毛细胞中，EndoG从细胞核外转移到细胞核内，细胞核中的EndoG显著增加;(3) 豚鼠耳蜗外淋巴灌流烷化剂MNNG后发生耳蜗外毛细胞凋亡和坏死，在凋亡和坏死的耳蜗外毛细胞中，AIF自线粒体转移到细胞核，其变化与噪声损伤引起耳蜗外毛细胞凋亡和坏死时一致。结论　噪声刺激或烷化剂MNNG灌流后，造成耳蜗外毛细胞DNA损伤，产生ssDNA，引起AIF和EndoG自线粒体释放，激活Caspase-3，AIF 和EndoG进一步向细胞核转移，最终使细胞核内的DNA降解，导致耳蜗毛细胞的死亡。

　　【关键词】 噪声 毛细胞

　　ssDNA production and EndoG translocation in noise exposure induced hair cell death

　　HAN Wei-ju, SHI Xiao-rui , Alfred NUTTALL

　　1　Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

　　2　Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University USA

　　3　Kresge Hresge Hearing Research Institute, The University of Michigan USA

　　【Abstract】 Objective　The changes of single strand DNA and EndoG were assessed to investigate the mechanism of noise exposure induced death of out hair cells(OHCs). Methods　The guinea pigs were divided into control, MNNG cochlear perfusion and noise exposure groups of 12 animals each . The mice were divided into control and noise exposure groups of 12 animals each. The cochleae of animals were dissected. Propidium iodide (PI), a DNA intercalating fluorescent probe, was used to trace the morphological changes in OHC nuclei. F-actin staining was used to determine missing OHCs. The single strand DNA(ssDNA) in apoptotic OHCs of guinea pigs and mice, and apoptosis inducing factor(AIF) and Endonuclease G(EndoG) in OHCs of guinea pigs were examined by immunofluorescence method. Morphological and flourescent changes were assessed using confocal microscopy in whole-mount organ of Corti preparations. Results　(1) After the animals were exposed to broadband noise at 122 dB SPL in 4 h/day for 2 days, both apoptosis and necrosis appeared in OHCs. The single strand DNA in apoptotic OHCs were observed both in guinea pigs and mice. (2) In normal OHCs, EndoG was distributed outside of nuclei. EndoG translocated from outside to inside of the nuclei in both apoptotic and necrotic OHCs following noise exposure. (3) The MNNG cochlear perfusion and noise exposure both caused the transloctation of AIF from the mitochondria to the nuclei. The translocation of AIF took place in both apoptotic and necrotic OHCs. Conclusion　These findings indicate that both noise exposure and cochlear MNNG perfusion injure the nuclear DNA of OHCs, then the action of Caspase-3 is triggered, AIF and EndoG are translocated to nuclei, and finally, DNA is broken and death of OHCs induced.

　　【Key words】　Noise exposure;　Out hair cell;　Apoptosis inducing factor;　Single strand DNA;　Endonuclease G

　　人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，在组织死亡之中至少有两种不同的细胞死亡过程：细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。噪声损伤引起的耳蜗外毛细胞死亡也有凋亡和坏死两种类型，但以凋亡为主[1-3]。我们以往的研究发现噪声导致耳蜗损伤时，在凋亡的耳蜗外毛细胞核内，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate- specific proteinase 即Caspase-3)被激活，在坏死的耳蜗外毛细胞内，没有Caspase-3 的激活;但在噪声损伤导致耳蜗外毛细胞凋亡和坏死时，都发生凋亡诱导因子(apoptosis inducing factors，AIF)自线粒体向细胞核内的转移[6]。本研究拟观察噪声损伤导致豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞死亡时细胞内单链DNA(single stranded DNA，ssDNA)和核酸内切酶G(endonuclease G，EndoG)的变化，以及烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)耳蜗内灌流引起豚鼠耳蜗外毛细胞死亡时AIF 的变化，并与噪声损伤后AIF的变化进行比较，以便进一步阐明耳蜗毛细胞死亡的机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物和噪声刺激

　　选用耳廓反射正常的白色健康豚鼠36只，C57BL/6小鼠24只，雌雄兼用。分笼喂养于21℃ ~ 24℃ 的环境中。豚鼠随机分为噪声暴露组、 MNNG灌流组和对照组，每组12只动物;小鼠随机分为噪声暴露组和对照组，每组12只。其中对照组和MNNG灌流组豚鼠未接触噪声。噪声暴露组豚鼠和小鼠各12只动物暴露于120 dB SPL的白噪声环境中每天4小时，共持续2天。

　　1.2　耳蜗内MNNG灌流

　　利用活体耳蜗外淋巴灌流技术进行耳蜗内灌流MNNG，以观察MNNG引起外毛细胞死亡时AIF的变化。耳蜗外淋巴灌流技术见参考文献[2， 3]，兹简述如下：豚鼠麻醉后，腹侧入路，暴露听泡，在耳蜗基底转和顶转外侧骨壁上分别钻一个小孔，用含0.5 mg/mlMNNG的人工外淋巴液灌注耳蜗外淋巴，灌流0.5小时，用外淋巴液冲洗，之后处死动物，分离耳蜗。

　　1.3　免疫组化染色

　　利用免疫组织化学方法染色，检测耳蜗毛细胞内的单链DNA、AIF和EndoG在细胞内的分布及噪声损伤引起毛细胞凋亡时的变化。灌流组MNNG灌流结束后、噪声暴露组第二天噪声暴露结束后以及对照组的动物，麻醉后取出颞骨，分离耳蜗，浸泡在人工外淋巴液中，解剖显微镜下分离去除耳蜗外侧骨壁，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定过夜。次日在显微镜下解剖分离含Corti器的耳蜗基底膜，撕去盖膜，0.02 mol/L磷酸缓冲液洗涤30分钟，0.5% 的Triton X-100通透1小时，再次用磷酸缓冲液洗涤后，用19% 羊血清阻断非特异性抗体，然后将组织移至1 ?滋g/ml的兔抗- ssDNA多克隆抗体(Dakocytomation，日本)、兔抗-AIF多克隆抗体(Chemicon International, Temecula，美国)或兔抗- EndoG多克隆抗体(Chemicon International， Temecula，美国)中染色，空白对照以生理盐水代替一抗，4℃冰箱内孵育20小时;1%小牛血清磷酸缓冲液洗涤后，二抗用羊抗兔IgG荧光抗体(其中ssDNA和EndoG 用Alexa Fluor 488羊抗兔抗体，呈绿色，AIF用Alexa Fluor 647羊抗兔抗体，呈蓝色，均为美国Molecular Probes公司产品)，抗体用1%小牛血清磷酸缓冲液稀释至1：100，20℃ 孵育1小时。再用碘化丙啶行细胞核染色。

　　1.4　碘化丙啶(propidium iodide，PI)标记细胞核

　　用碘化丙啶(PI)(美国Molecular probes公司)染色细胞核，通过观察细胞核的形态特点，以确定毛细胞的凋亡或坏死。Corti 器在抗ssDNA抗体、抗EndoG抗体和抗AIF抗体孵育后，在含　　5 ?滋g/ml PI(Molecular Probes公司，美国)的磷酸缓冲液中染色10分钟，0.02 mol/L磷酸缓冲液洗涤30分钟;或者用Alexa Fluor 568 Phalloidin(美国Molecular Probes公司)染色F-actin，以观察细 胞数量的变化。然后制备耳蜗铺片，进行形态学观察。

　　1.5　形态学观察和细胞成像

　　制备耳蜗铺片后，利用激光扫描共聚焦显微镜 (Bio-Rad，MRC 1024ES)成像技术来进行形态学观察，并实施细胞成像。耳蜗毛细胞同时用红色的PI(或phalloidin)和绿色的ssDNA、EndoG(或蓝色的AIF)行双重染色，激光扫描共聚焦显微镜下可以同时扫描出两种不同的颜色，扫描范围包括整个Corti器，从外毛细胞的顶端开始扫描，至毛细胞的底部结束，扫描间距为1 ?滋m。成像有两种形式，一种是某一个扫描层面(如经过细胞核的层面)的成像，观察毛细胞的局部;另一种是从毛细胞顶端到底部扫描40 - 60(因细胞的长短而有所不同)个层面，再进行投射(Projection)成像，观察细胞的全貌。

　　2　结　果

　　2.1　噪声损伤后耳蜗外毛细胞的死亡

　　正常的豚鼠和小鼠耳蜗毛细胞排列整齐，PI染色显示细胞核，Phalloidin染色整个细胞的骨架，三排外毛细胞，一排内毛细胞均整齐排列。噪声暴露后豚鼠和小鼠耳蜗的外毛细胞均出现不同程度的死亡，有凋亡和坏死两种形式，PI染色显示细胞核固缩或碎裂者为凋亡的外毛细胞，PI染色显示细胞核肿胀，细胞核体积增大者为坏死的外毛细胞，而Phalloidin染色显示豚鼠耳蜗外毛细胞有死亡引起的缺失(图1)。

　　2.2　噪声暴露引起耳蜗外毛细胞凋亡时ssDNA的产生

　　正常豚鼠和小鼠的耳蜗外毛细胞的细胞核排　列整齐，没有肿胀、皱缩或碎裂的细胞核，没有　ssDNA;噪声损伤后豚鼠和小鼠的耳蜗出现细胞核皱缩、碎裂的凋亡外毛细胞，在凋亡的耳蜗外毛细胞核内有ssDNA，而没有凋亡的耳蜗毛细胞内没有ssDNA。提示噪声损伤致豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时会产生断裂的单链DNA(图2和图3)。

　　2.3　噪声暴露引起耳蜗外毛细胞死亡时EndoG 的转移

　　在正常耳蜗外毛细胞，EndoG分布于细胞核外，在细胞核内没有EndoG的分布， 噪声暴露后，耳蜗外毛细胞核内的EndoG增加，而在噪声导致外毛细胞凋亡和坏死时，EndoG自细胞核外显著转移到细胞核内(图4)。

　　2.4　MNNG灌流引起耳蜗外毛细胞死亡时AIF的转移

　　在正常耳蜗外毛细胞，AIF呈环形分布于细胞核外，在细胞核内没有AIF的分布，耳蜗内灌流MNNG后，导致部分外毛细胞凋亡和坏死，同时发生AIF自线粒体向细胞核内的转移，而在细胞核形态正常的外毛细胞内没有发生AIF的转移，仍然集中于线粒体内;与噪声暴露导致部分外毛细胞凋 亡和坏死时AIF自线粒体向细胞核的转移相似 (图5)。

　　3　讨　论

　　人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，在组织死亡之中至少有两种不同的细胞死亡过程：细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。受到急性伤害时，细胞迅速肿胀，线粒体结构破坏，细胞核、细胞器、原生质膜破坏，细胞内容物溢出，导致周围组织炎症发生，称之为细胞坏死[5-7]。而细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed cell death)是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，从形态学、生化和分子水平上与细胞坏死有明显的区　　别[8]。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程[9， 10]。如果在细胞的死亡过程中，细胞以凋亡的方式死亡，则原生质膜没有破坏, 细胞内容物不会溢出, 不会导致周围组织炎症发生，胚胎形成、衰老和损伤的细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等病理生理过程都与细胞凋亡有密切的关系。噪声损伤引起的耳蜗外毛细胞死亡也有凋亡和坏死两种类型，但以凋亡为主[1-3]。我们以往的研究发现，噪声损伤导致耳蜗外毛细胞凋亡时, 耳蜗外毛细胞核内的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific proteinase 即Caspase-3)被激活，而在坏死的耳蜗外毛细胞内没有Caspase-3 的激活[6];但在噪声损伤导致耳蜗外毛细胞凋亡和坏死时，线粒体内的AIF均向细胞核转移。本研究比较了烷化剂MNNG耳蜗内灌流和噪声损伤引起豚鼠耳蜗毛细胞死亡时AIF 的变化，以及噪声损伤时豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时细胞核内单链DNA的产生及核酸内切酶G(EndoG)在毛细胞发生凋亡和坏死时的变化，以便进一步阐明耳蜗毛细胞死亡的机制。

　　凋亡对于维持组织细胞内环境的稳定，保持组织细胞的持续更新具有重要意义，在各种原因引起的细胞凋亡过程中，染色体DNA发生渐进的分阶段的断裂，首先在内源性水解酶的作用下降解为50 - 300 kb 的大片断，其中有双链和单链断裂DNA;然后大约30%的染色体DNA在Ca2+、Mg2+离子依赖的核酸内切酶作用下，将核染色体从核小体间裂断，形成寡核苷酸片段，从而产生有游离3′-羟基末端的DNA断链。以往的原位末端标记技术正是利用这一特征检测细胞凋亡的，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)[11]。单链断裂DNA 片断不仅可以在确已凋亡的细胞中出现，而且也出现在形态暂时正常但很快要进入凋亡过程的细胞中，也就是说，单链DNA的出现是细胞凋亡早期的一种表现。本试验中一抗使用兔抗-ssDNA多克隆抗体，二抗用抗兔IgG荧光抗体，发现在正常豚鼠和小鼠的耳蜗外毛细胞内没有ssDNA，而噪声损伤后豚鼠和小鼠的耳蜗出现细胞核皱缩、碎裂的凋亡外毛细胞，在凋亡的耳蜗外毛细胞核内有ssDNA抗体染色，而没有凋亡的耳蜗毛细胞内未检测到ssDNA。提示噪声损伤致豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡的早期会产生单链DNA。利用抗单链DNA抗体能特异地结合单链DNA的特性，通过免疫组织化学和荧光染色技术，可以早期发现细胞的凋亡，而且直接的免疫组织化学方法较TUNEL方法简便易行。

　　在本研究中，我们向耳蜗内灌流了烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，以观察MNNG引起外毛细胞凋亡时AIF的变化，并与噪声损伤时耳蜗毛细胞内AIF的变化相比较，发现烷化剂MNNG灌流引起的耳蜗毛细胞死亡时AIF的变化与噪声损伤时相似，观察到噪声损伤和烷化剂MNNG灌流引起的耳蜗外毛细胞死亡有凋亡和坏死两种方式;在MNNG导致的耳蜗外毛细胞坏死和凋亡时，均发生AIF自线粒体向细胞核的转移，说明AIF自线粒体向细胞核的转移是细胞死亡过程中的一个重要环节。我们还观察了细胞核内另外一个重要的酶—核酸内切酶G(EndoG)在细胞内的分布及其在噪声损伤引起毛细胞凋亡和坏死时的变化，发现在正常耳蜗毛细胞，EndoG分布于细胞核外，在细胞核内没有EndoG的分布; 噪声暴露后，耳蜗外毛细胞核内的EndoG增加，而在噪声导致外毛细胞凋亡和坏死时，EndoG明显地自细胞核外转移到细胞核内。AIF和EnddoG在正常情况下位于线粒体内膜，对于维持线粒体的正常功能具有重要作用[12-18]。线粒体作为细胞生命活动重要的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心;作为细胞内能量代谢的主要场所，同时也是活性氧和自由基产生的主要场所[12-14]，因此，氧自由基的产生和积聚容易造成线粒体的损伤。细胞受到氧化刺激等损伤时，例如噪声损伤引起耳蜗毛细胞线粒体内的氧自由基增加时，或耳蜗内灌流烷化剂MNNG作用于耳蜗毛细胞时，导致耳蜗毛细胞的DNA损伤，成为细胞凋亡的触发因子，产生单链DNA，本实验中　即观察到在豚鼠和小鼠凋亡的外毛细胞中产生　　ssDNA。DNA损伤 引起AIF从线粒体释放到细胞质，激活了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族的某些成员， Caspase-3是其中的重要一员， 是凋亡的重要执行者和哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[19-20]。我们以往的研究中观察到噪声损伤导致耳蜗外毛细胞凋亡时，Caspase-3被激活[6]。而AIF进一步从细胞质转移到细胞核内，参与凋亡过程中DNA的降解[20]。本项研究表明AIF和EndoG从线粒体释放并向细胞核转移可能是细胞凋亡的关键步骤。

　　尽管耳蜗毛细胞凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但根据本试验，结合我们以前的研究结果提示，噪声刺激或烷化剂MNNG灌流后，造成耳蜗外毛细胞细胞核内DNA的损伤，产生单链断裂DNA，而DNA损伤 引起AIF和EndoG自线粒体释放，激活Caspase-3，发生耳蜗外毛细胞凋亡，AIF和EndoG进一步向细胞核转移，最终使细胞核内的DNA降解，最终导致耳蜗毛细胞的死亡。

　　【参考文献】

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