神经干细胞与乳鼠基底膜共培养后分化为毛细胞样细胞的研究

　　【摘要】 目的　探讨体外培养和鉴定胚胎大鼠神经干细胞及诱导其分化为毛细胞样细胞。方法　从SD系胚鼠大脑分离神经干细胞，在无血清培养基中培养。取乳鼠基底膜与神经干细胞一起培养，14 ～ 21天后通过免疫荧光和免疫组化法检测毛细胞标志物myosin VIIa和calretinin。结果　培养的神经干细胞胞体透亮，折光性好，Nestin鉴定阳性。诱导分化后的细胞免疫荧光和免疫组化示myosin VIIa和calretinin阳性。结论　无血清条件下能培养出活性很好的神经干细胞，乳鼠基底膜能引导其朝毛细胞方向分化。

　　【关键词】 神经干细 基底膜 分化 毛细胞样细胞

　　Differentiation of neural stem cells into hair cell-like cells by co-culturing with basilar membrane of newborn rats

　　CHEN Qing-guo, FU Yong， WANG Xian-hong, WU Xiao-hui, XIE Jing, LI Zhe-wen, GOMG Shu-sheng，

　　1　Department of Otolaryngology， 3 Department of Clinical Laboratory, Union Hospital, Huazhong

　　University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei, China;

　　2　Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Xianning College, Xianning 437100, Hubei, China; Present address: Department of Otolaryngology， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310003, Zhejiang, China;Corresponding author: GONG Shusheng, Email: gongss@ccmu.edu.cn; Present address: Department of

　　Otolaryngology, Beijing Tongren Hospital of Capital Medical University, Beijing 100730, China

　　【Abstract】 Objective　To investigate the method for culturing and identifying neural stem cells(NSCs) from rat embryos in vitro and inducing them to differentiate into hair cell-like cells. Methods　NSCs were isolated from the brain of Sprague-Dawley rat embryos and cultured in serum-free conditional medium. The basilar membrane was isolated from post natal day 0 - day 3 rats and cultured in DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum. Then NSCs were co-cultured with basilar membrane for 14- 21 days. The expression of hair cell markers(myosin VIIa and calretinin) was detected by immunocytochemical analyses. Results　The cell bodies of NSCs were transparent with good refraction and marked by stem cell marker nestin. After differentiation, the cells were immunoreactive for myosin Ⅶa and calretinin, the hair cell marker. Conclusion　NSCs grew well in serum-free conditional medium and they could be induced to differentiate into hair cell-like cells when co-cultured with basilar membrane from newborn rats.

　　【Key words】　Neural stem cells(NSCs);　Basilar membrane;　Differentiation;　Hair cell-like cells

　　神经干细胞(NSCs)是指来源于神经系统，具有自我更新能力，并通过不对称分裂产生除自身以外的其它类型细胞的一种细胞[1]。大多数情况下，NSCs分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞，但有研究表明，NSCs也可以诱导分化为其它类型细胞，如髓系细胞、淋巴样细胞及毛细胞。这是因为NSCs具有多向分化潜能，微环境对它的分化方向有很大的影响，往往能引导其朝与之相似的组织类型分化。本实验将胚胎大鼠大脑NSCs与乳鼠基底膜一起培养，观察其分化情况，为将NSCs注射到内耳治疗感音神经聋提供理论基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验材料

　　1.1.1　实验动物: 孕16~ 18天的SD系大鼠(Sprague-Dawley rat)10只，出生3天以内的乳鼠50只，由华中科技大学同济医学院动物中心提供。

　　1.1.2　实验试剂：DMEM/F12(1:1)(Hyclone)，B27(Gibco)， 20 ng/ml bFGF(Peprotech)， 20 ng/ml EGF(Peprotech)， 100 U/ml 青霉素， 兔抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体(博士德)，兔抗myosin Ⅶa(肌球蛋白Ⅶa)多克隆抗体(1:500， Abcam)，兔抗calretinin(视网膜钙蛋白)多克隆抗体(1:200， Neomarkers)，Alexa 594标记的二抗(1: 500，Molecular Probes)，SABC-FITC(SABC-荧光素异硫氰酸盐)免疫荧光试剂盒(北京中杉)，SABC免疫组化试剂盒(北京中杉)，Hosechst 33258(北京中杉)，胎牛血清(Gibco)，多聚赖氨酸(北京中杉)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　NSCs的体外培养及鉴定

　　1.2.1.1　NSCs的分离和培养: 孕16 ～ 18天的SD系大鼠用75% 酒精消毒腹部30分后剖腹取出胎鼠,放到超静工作台中，在解剖显微镜下取海马区脑组织，仔细剥除脑膜后置入冰冷的D-Hanks液中，用眼科剪剪成组织小块，吸管轻柔吹打100 ～ 200次制成乳糜状悬液，过200目细胞筛以除掉较大的组织块。然后转移到离心管中，在1000转/分的速度下离心5分，去上清液后加入神经干细胞培养基(由DMEM/F12， 2% B27， 20 ng/ml bFGF，20 ng/ml EGF，100 U/ml 青霉素组成)，反复吹打，制成细胞悬液。以1 × 107/ml的密度接种到50 ml无菌培养瓶中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，每3 ～ 4天换液一次。

　　1.2.1.2　NSCs的传代: 当细胞球中央区域开始变黑时即需要传代，反复吹打使之成单细胞悬液，调整细胞密度为1 × 107/ml，再接种，培养条件同前。此后每隔3 ～ 4天换液1次，6 ～ 7天机械吹打传代一次。

　　1.2.1.3　NSCs的诱导分化：将原代培养7天的神经干细胞球反复吹打，离心后弃上清液，将细胞重悬于含10% 胎牛血清的DMEM/F12(1:1)中，然后将其转移到含多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板中，在37℃、5% CO2条件下培养，培养基1星期换2次。

　　1.2.1.4　NSCs的鉴定：取生长良好的神经干细胞球接种到含多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板中,待其贴壁后加入4% 多聚甲醛固定30分，磷酸缓冲液(PBS)洗3次，用0.3% Triton X-100处理15分以增加细胞的渗透性，PBS洗3次，10% 正常羊血清封闭30分钟,之后加入一抗nestin(1: 200)，37℃、5% CO2条件下1 ～ 2小时，再用PBS洗3次，加入SABC-FITC标记的二抗(1：100)室温孵育30分，50% 甘油封片后在荧光显微镜(OLYMPUS，IX71，激发光波长493 nm，发射光波长517nm)下观察。

　　1.2.2　诱导NSCs分化为毛细胞样细胞

　　1.2.2.1　神经干细胞核Hosechst 33258标记: 往原代活性良好的神经干细胞球中加入Hosechst 33258，终浓度为10 ?滋g/ml，37℃、5% CO2条件下孵育40 ～ 60分，800转/分离心5分，弃上清后加入DMEM/F12吹打，再离心去除上清液，重复三次，洗掉多余的Hosechst 33258，加入新鲜的培　养基。在荧光显微镜(OLYMPUS，IX71，激发光波长364 nm，发射光波长460 nm)下观察核染色情况。

　　1.2.2.2　新生鼠基底膜的培养: 取10只乳鼠，75%酒精消毒30分后用无菌的D-Hanks液冲洗3次。在超静台中剪开颅腔，去除脑组织，暴露颅底，分离双侧颞骨，置入冰冷的无菌D-Hanks液中。在解剖显微镜下依次剥离外耳道周围、耳蜗表面组织，用尖镊挑开耳蜗外的软骨壁，暴露基底膜，将其从蜗轴上分离后放到用多聚赖氨酸包被的培养皿中培养，培养基为含10% 胎牛血清的DMEM/F12(1:1)，2 ～ 3天换液一次。

　　1.2.2.3　NSCs与乳鼠基底膜一起培养: 将生长旺盛的用Hosechst 33258标记的神经干细胞球(约20 ～30个)转移到含10% 胎牛血清的DMEM/F12(1：1)培养基中与乳鼠基底膜一起培养。由于乳鼠基底膜一般只能存活几天，因此当观察到其颜色变暗逐渐分解时需重新加入新鲜的基底膜，分解的基底膜不用取出，因为从其游走出来的细胞也可能对干细胞的分化起作用。整个实验过程一般需取基底膜5 ～ 6次，每次取20个，共计培养14 ～ 21天，3 ～ 4天半量换液一次。对照组为单独神经干细胞培养分化，期间不加乳鼠基底膜。

　　1.2.2.4　毛细胞样细胞的检测:培养14 - 21天后先加抗myosin VIIa抗体，接着加入Alexa Fluor 594标记的二抗，封片后在倒置荧光显微镜(OLYMPUS，IX71，激发光波长590nm，发射光波长617nm)下看荧光。另外用免疫组化法检测calretinin：4% 多聚甲醛固定、0.25% TritonX-100破膜、10% 正常羊血清室温条件下封闭30分钟，然后加1: 200稀释度兔抗calretinin多克隆抗体4℃ 孵育过夜，再加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，最后加SABC，DAB显色后在倒置显微镜(OLYMPUS，IX71)下观察。随机选取 10个不同视野，计数分化比例，结果用百分比表示。

　　2　结　果

　　2.1　NSCs的培养及鉴定

　　原代培养第1天可见许多大小不一的白色絮状物连在一块，考虑为脑膜没有被完全剥离所致，显微镜下可以看见许多干细胞连成一片，呈不规则片状，将培养液用200目细胞筛过滤，除去体积较大的脑膜及非神经组织，从而提高干细胞的纯度。第2天仍然可以看见少许白色絮状物体，同样经200目细胞筛处理，第3天便可以看到大量单个神经干细胞及少许大小不一的细胞球。此后，培养基中的杂质细胞越来越少，逐渐变得清亮。第7天，单个神经干细胞分裂聚集成呈圆形的干细胞球，胞体透亮，折光性好(图1)。用nestin标记可见圆形的神经干细胞球发出绿色荧光(图2)。

　　2.2　乳鼠基底膜培养

　　培养第1天可见基底膜透亮，活性良好(图3)，高倍镜下可见毛细胞区。第2天基底膜贴壁，大量成纤维细胞从其周围游走出来。第3天可见基底膜颜色开始变暗，毛细胞区变模糊，此后基底膜结构变疏松，随即分解。

　　2.3　毛细胞样细胞免疫荧光及组化染色

　　与基底膜一起培养的NSCs分化后呈myosin　Ⅶa阳性，胞浆着红色(图4)，图5与图4为同一视野被Hosechst 33258标记的细胞核图像，图6为图4与图5的合成图，其中可以看出被Hoechst 33258标记细胞核的NSCs中只有小部分可以表达抗原myosin Ⅶa，所有视野平均分化比例约为17.1%，其它的很可能分化为神经元或胶质细胞。Calretinin免疫组化示分化后的细胞胞体染色呈深褐色，Hoechst 33258标记的细胞核发出蓝光(图7)。所有视野中，胞核呈蓝色的细胞中平均约有27.4% 的胞浆表达Calretinin。NSCs单独培养分化后的细胞myosin Ⅶa和Calretinin的免疫荧光和免疫组化分别为阴性。

　　3　讨　论

　　3.1　NSCs的培养及鉴定

　　本试验通过取胚鼠海马组织体外培养NSCs。培养基为无血清培养基,主要含EGF和bFGF这两种重要的生长因子，它们，尤其是bFGF，对NSCs的增殖和分化有重要作用，培养初始的培养基中若缺少bFGF会导致很少形成干细胞球，即使后来再加入bFGF效果也不明显[2]。对EGF敏感的NSCs大多分化为胶质细胞，而对bFGF敏感的干细胞更倾向于分化为神经元[3]。Nestin是鉴定NSCs常用的特异性分子标志物，是一种仅存在于多潜能神经外胚层细胞中的中间丝蛋白,当神经上皮开始分化后逐渐消失[4]。

　　3.2　诱导NSCs分化为毛细胞样细胞

　　哺乳动物胚脑中的NSCs可见于皮质、室管膜下区、海马、纹状体等。通常认为NSCs的分化能力仅限于分化为神经元和胶质细胞，但最近研究表明NSCs可以在特殊的诱导条件下突破这种分化的限制，从而具有跨系分化的能力。将胎鼠或成鼠NSCs移植到经辐射而破坏了造血功能的大鼠的骨髓，发现其能产生造血细胞、髓系细胞和淋巴样细胞[5]。将NSCs注射到鸡胚囊中，结果它可以生成所有胚层的细胞[6]。同样，在某种环境下干细胞可以诱导分化为与内耳听觉信号传导有关的细胞。有研究者取6周龄小鼠的耳蜗，先用酶消化后再过滤去除组织块，放到培养板中培养，取其培养基的上清液，离心过滤后与小鼠嗅球干细胞一起培养一段时间，发现后者表达毛细胞标志物phalloidin、 myosin Ⅶa、espin、calretinin和prestin，这可能是由于耳蜗培养液中含有某种生长因子诱导嗅球干细胞向毛细胞方向分化[7]。还有研究者将出生五天的乳鼠耳蜗取出与胚胎干细胞一起培养，发现后者可以分化为双极听觉神经元[8]，未来有望将其移植到感音神经性聋的哺乳动物的耳蜗中，有可能取代变性神经元而发挥传导听觉信号的作用。国内有研究将新生豚鼠神经干细胞放在人工外淋巴液与基础培养基的混合液中培养，发现分化后的细胞有11.4% ～13.6% 表达myosin Ⅶa[9]。本试验取出生三天内乳鼠基底膜，与NSCs一起培养14 ～ 21天，发现分化后的NSCs表达毛细胞标志物 myosin Ⅶa 和　calretinin。为了与基底膜上的毛细胞或支持细胞区分开来，先用Hosechst 33258标记神经干细胞核，再与基底膜一起培养，以证明分化后的胞核呈蓝色的细胞是来源于NSCs。将乳鼠基底膜取出体外培养的目的是创造一个与内耳相似的环境,基底膜中含有的毛细胞和支持细胞等可能分泌多种神经营养因子，引导NSCs朝毛细胞方向分化。myosin VIIa是目前认为特异性比较高的毛细胞标志物[10]，而calretinin则是毛细胞早期标志物[11]，两者均在细胞胞浆表达。此外，Brn-3c、Math1等也在毛细胞生长发育过程中表达。由于目前尚没有公认的毛细胞特异性标志物，因此由NSCs分化出来的所谓的“毛细胞”只能称为毛细胞样细胞，其形态和生理功能与活体毛细胞尚有很大的区别。

　　3.3　前景及问题

　　NSCs的多向分化潜能决定了它在受损神经系统的修复治疗上有着巨大的潜力。将NSCs移植到弥漫性脑损伤小鼠模型的大脑中，发现其能降低神经损害的程度[12]。也有人将NSCs移植到人为致伤的大鼠的脊髓后发现其能促进轴突广泛再生[13]。这种潜力同样体现在听觉系统。将NSCs注射到经强噪声暴露的小鼠和豚鼠的内耳鼓阶一段时间后，NSCs兼备神经细胞和毛细胞的特征;此外，经强噪声暴露且鼓阶注射了NSCs的动物内耳中卫星细胞和I型螺旋神经节神经元的数量明显多于经强噪声暴露但没注射NSCs的动物[14]。将NSCs移植到药物致聋的豚鼠内耳，发现其能生存并分化成神经细胞，并且可以迁移到感觉上皮附近，与螺旋神经节细胞比邻[15]。本实验只对NSCs体外分化为毛细胞样细胞作了初步的探索，如何提高其分化为毛细胞的比例，如何进一步诱导其分化为与活体毛细胞生理功能无异的细胞，以及将分化后的毛细胞移植到内耳治疗感音神经性耳聋等则有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1　Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science, 2000, 287(5457): 1433-1438.

　　2　Santa-Olalla J, Covarrubias L. Basic fibroblast growth factor promotes epidermal Growth factor responsiveness and survival of mesencephalic neural precursor cells. J Neurobiol, 1999, 40(1): 14-27.

　　3　David AA, Temples S. Self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.Nature, 1994, 372(6503): 263-266.

　　4　Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 1990, 60(4): 585-595.

　　5　Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA, et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science, 1999, 283(5401): 534-537.

　　6　Clarke DL, Johansson CB, Wilbertz J, et al. Generalized potential of adult neural stem cells. Science, 2000, 288(7451): 1660-1663.

　　7　Doyle KL, Kazda A, Hort Y, et al. Differentiation of adult mouse olfactory precursor cells into hair cells in vitro. Stem Cells, 2007，　25(3)： 621-627.

　　8　Coleman B, Fallon JB, Pettingill LN, et al. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Exp Cell Res, 2007, 313(2): 232-243.

　　9　王英， 董明敏， 高嵩涛. 人工外淋巴液诱导新生豚鼠海马神经干细胞分化的实验研究. 中国现代医学杂志， 2006， 16(17)： 2586-