芪棱汤对大鼠脑缺血再灌注后一氧化氮的影响

　　[摘 要] 目的：观察芪棱汤对脑缺血再灌注损伤后一氧化氮的影响，为益气养阴活血法治疗缺血性中风提供实验依据。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组及芪棱汤组。采用颈内动脉线栓加环扎法复制大鼠脑缺血再灌注模型。于再灌注后不同时间点观察大鼠缺血脑组织的一氧化氮(NO)含量。结果：模型组NO含量较假手术组高(均P<0.01)，补阳还五汤组、芪棱汤组的NO含量较模型组低(P<0.05)，芪棱汤组在降低NO方面优于补阳还五汤组(P<0.05)。结论：芪棱汤可降低NO的含量，从而对脑缺血再灌注所导致的脑损伤起保护作用。

　　[关键词] 脑缺血再灌注;芪棱汤;益气养阴活血;一氧化氮

　　Influence of Qileng Decoction on expression of nitric oxide after focal Cerebral Ischemic Reperfusion in Rats Deng Shi-Fang1 ,Jiang Hong-Yu1 ,Zhang Shi-Wei1 ,Cao Ping2 (1 Shenzhen People’s Hospital,the Second clinic Medical College,Jinan University shenzhen 518020 2 Shenzhen longgang People’s Hospital shenzhen 518000)

　　Abstract : Objective To explore the Influence of Qileng Decoction on expression of nitric oxide after focal cerebral ischemic reperfusion in Rats,and to provide the scientific foundation for benefit vital energy(BVE),nourishing in(NY),activating blood circulation(ABC)on treating ischemic stroke. Methods: The rats were randomly divided into four groups including sham-operation,model group,Buyanghuanwu(BYHW) decotion group and Qileng decoction group.The model of focal cerebral ischemic reperfusion injury was made by using thread embolizing and fastening of the ICA in rats. the content of nitric oxide was measured by nitrate reductase method at different time point after cerebral ischemic reperfusion. Results：the content of nitric oxide in model group was significantly higher than sham-operation group(P<0.01),and those in BuYangHuanWu decoction group and QiLeng decoction group decreased significantly compared with the model group (P<0.05). Contrasted with BuYangHuanWu decoction group, the content of NO in QiLeng decoction group decreased remarkably.Conclusion: QiLeng decoction plays the nerve protective effect by reducing the content of nitric oxide, It may be one of the mechanism of BE-NY-ABC treating ischemic stroke.

　　Key words: Cerebral is Chemic Reperfusion; Qileng Decoction;BE-NY-ABC;Nitric Oxide

　　在脑血管疾病的发病中，缺血性中风约占55%～80%[1],而半数以上的病例其病理生理过程是一个缺血后再灌注的过程，其机理与自由基、神经兴奋毒性、钙超载及NO等诸多因素有关。我们研究了芪棱汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后NO的影响。现报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料：(1)SD雄性大鼠96只，SPF级，体重300±30 g，月龄10个月。由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2003A028。(2)药品与试剂：芪棱汤精制液、补阳还五汤精制液由深圳市人民医院制剂中心提供，每毫升含生药0.1 g。考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、一氧化氮试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。(3)实验仪器：722S分光光度计、LDZ4-0.8自动平衡微型离心机、电热恒温水温箱、AG204 电子分析天平、漩涡振荡器、组织研磨器。

　　1.2 实验方法：(1)动物分组：用EXCEL2000中“=RAND()”命令随机分为以下4组：假手术组(n=6)、模型组(n=30)、补阳还五汤组(n=30)、芪棱汤组(n=30)。除假手术组外，各组又随机平均分为缺血2 h再灌注1 h组、再灌注3 h组、再灌注24 h组、再灌注48h组、再灌注72 h组。(2)造模：除假手术组外，其余各组均采用Zea longa[2]颈内动脉线栓加环扎法。假手术组仅分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉及迷走神经，并不插入线拴。(3)给药：根据随机分组的结果依次在实验前24 h、12 h及皮肤缝合后即刻腹腔注射相应药物(各4 ml)，即芪棱汤组予芪棱汤精制液，补阳还五汤组予补阳还五汤精制液，模型组和假手术组予生理盐水。以后每隔12 h给药一次。采用盲法给药。(4)标本的取材：既定时间各组断头，剪开颅骨取脑。

　　1.3 NO的检测：采用硝酸还原酶法测定，具体分以下步骤进行:(1)脑组织匀浆的制备：大鼠断头后，取大脑皮质组织约1 g置于冰冷的生理盐水中漂洗，去血拭干后，称重，放入组织研磨器(即匀浆管)中。用移液管量取0.9%的冷生理盐水(其体积总量是组织块重量的9倍)于匀浆管中，上下转动数十次，充分研碎，使组织匀浆化。上述操作均在冰浴中完成。再将制备好的脑匀浆用离心机3000 r/min离心15 min，留上清液。(2) NO的测定：取脑组织上清液采用硝酸还原酶法测定NO的含量，具体操作严格按照考马斯亮兰蛋白测定试剂盒及NO测定试剂盒说明书进行。

　　1.4 统计学方法：各项指标均以`c±s表示。在方差齐性检验后，再进行两样本均数t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　随着脑缺血再灌注时间的延长，模型组各时间段NO表达较假手术组升高，均有统计学意义(1 h段P<0.05，其余各时间段均P<0.01);补阳还五汤组与模型组比较，除1 h、48 h、72 h外，其他时间段NO表达下降明显，差异显著(24 h段P<0.01，3 h段P<0.05);芪棱汤组与模型组比较，除1 h、48 h、72 h外，其他时间段NO表达下降明显，差异显著(3 h和24 h均P<0.01);而芪棱汤组在3 h、24 h段降低NO的表达方面要优于补阳还五汤组(P<0.01)。见表1。

表1 不同组别NO的含量（μmol/gprot）

注：不同分组与假手术组比较，²P< 0.01，⁵P< 0.05；各组与模型组比较，³P< 0.01，³³P< 0.05；各组与补阳还五汤组比较，⁴P< 0.01。

　　3 讨论

　　在缺血性中风的发病过程中，除气虚血瘀这一主要病机外，阴虚致瘀也是重要的发病机理。蒋红玉教授认为，人到中年，肾气不足，水不涵木，导致肝肾阴虚，津少血亏，不能充盈血络，则血行不畅，瘀血内生;阴虚燥热，津枯血滞，导致瘀阻脉络，而通过养阴法可滋补津液，以增水行舟，从而促进活血化瘀的功效，故在益气活血的基础上，结合“增液行舟”的养阴活血理论，自创益气养阴活血方剂——芪棱汤，并运用于临床治疗脑血管疾病，取得了良好的疗效[3]。该方以黄芪、三棱为君，黄芪益气，帅血运行，三棱破血祛瘀，兼以行气;以桑椹、花粉为臣，生津滋阴养血。补气之品配养阴之剂以益气化瘀、增液行血;活血之品得补气养阴之药则活血之功效倍增，并可避免活血化瘀药引发的伤络出血，发挥益气养阴，活血化瘀，疏通脑络的作用。

　　目前研究发现，NO具有脑保护和神经毒性双重作用。在生理条件下，NO起到脑保护作用，而在病理性刺激下，如脑缺血时产生的NO则具有神经毒性，能抑制线粒体的功能，导致神经元的灭亡。在我们前期的电镜研究中就发现，芪棱汤通过保护神经细胞线粒体结构的完整性来发挥神经保护作用。本实验发现，与假手术组比较，各组脑缺血再灌注1 h后NO表达即开始逐渐增多，尤其在24 h达高峰，48 h后又逐渐减低，但较再灌注1 h仍明显增高，这与以往的研究结果大致相同[4]。我们认为各组不同时间段NO的表达增多，主要是由于神经元型一氧化氮合酶(Neuronal Nitric Oxide Synthase, nNOS) 和诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)的活性增加引起，nNOS在脑缺血再灌注早期释放，而iNOS在中晚期大量且持续的产生，且nNOS维持时间短，故各组的NO含量在再灌注不同时间段均有不同程度的增高，3 h、24 h尤为显著，中晚期后由于nNOS的消失，则NO含量增加的幅度又逐步下降，但由于iNOS的不断产生，故仍高于假手术组。本实验结果提示，在脑缺血再灌注期间，大鼠脑组织NO的表达明显升高，而使用药物治疗后，能有效降低大鼠脑组织NO的表达，尤以3 h、24 h段明显;再灌注24 h时，芪棱汤组较补阳还五汤组更能减少NO表达，说明芪棱汤通过抑制NO的合成来保护神经细胞，为益气养阴活血法治疗缺血性中风提供了理论依据。

　　4参考文献

　　[1] 刘 轲.论益气化瘀法是防治缺血性中风的主要方法[J].山西中医，2003，19(6)：1-3.

　　[2] Zea Longa E , Weinsten PR, Carlom S . Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

　　[3] 蒋红玉，张思为，陈欣童.芪棱汤治疗脑梗塞34例疗效观察[J].新中医，2002，34(12)：35-36.

　　[4] 帅 杰，董为伟.局灶性脑缺血一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂的作用机制[J].中华神经科杂志，1997,30(4):227-230.