慢性肾小球肾炎患者尿一氧化氮代谢产物测定及临床意义

　　【摘要】 目的：我们测定慢性肾小球肾炎患者尿中NO代谢产物的排泄，以了解慢性肾小球肾炎患者肾组织内NO合成是否降低。方法：参照Rosslli和Green测定。结果：1.慢性肾炎有高血压组尿中NO代谢产物与对照组和无高血压组尿中NO代谢产物比较均明显降低p<0.01;慢性肾炎无高血压组尿中NO代谢产物与对照组比较，无统计差异P>0.05。2.MsPGN和FSGS组尿中NO代谢产物明显低于对照组和MN、MCD组P<0.01，而MN、MCD与对照组比较无差异P>0.05。结论：慢性肾小球肾炎合并高血压时尿中NO/Cr明显降低，提示肾组织内NO的产生可能不足，补充L-精氨酸会对其有利，这也许是测定肾小球肾炎患者尿中NOx-/Cr比值的临床意义所在。

　　【关键词】 慢性肾小球肾炎 一氧化氮

　　MEASUREMENT AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF NITRIC OXIDE METABOLITES IN CHRONIC GLOMERUL ONEPHRITIS PATIENT’S URINE

　　Lu wen，Wang yi ping. Bao Shan,Shu guang Hospitail Branch, 201900

　　【Abstract】Objective: NO(Nitri Oxide)metabolites in chronic glonerulonephritis patient’s urine were examined to know the synehase of NO in patient’s kidney.Method:reffer to Rosslli and Green method.Result:1.The synthase of NO metalites in the urine form chronic glomerulonephritis patient with hypertension is significantly reduced(p<0.01)comparing with the synthase in control or in non-hypertension.the synthase in non-hypertension has no significant difference (p>0.05)comparing with contol.2.The synthase of NO metabolites in either MsPGN group or FSGS group is significantly reduced(p<0.01) comparing respectively with the synthase in control or MN、MCD group.Whereas the comparison of MN、MCD with control shows no significanl difference (p>0.05).Result ：The ratio of NO/Cr in chronic glomerulonephritis with hypertension of NO synthase in urine is significantly reduced .Supplement L-arginine would be pro baly helpful. This is might be the singnifience of examining the ratio of NOx-/Cr in chronic glomerulonephritis patient’s urine.

　　【Key】: Chronic glomerulonephritis NO

　　慢性肾脏疾病进展机制及如何延缓、阻止甚至逆转慢性肾脏疾病肾功能进行性损害是目前肾脏病领域研究的热点课题之一。肾小球系膜过度增值殖和过度合成细胞外基质或者细胞外基质降解减少是肾小球硬化的病理基础。目前所知，肾小球系膜细胞增殖和合成细胞外基质受许多因素的调控，特别是近几年来研究发现一氧化氮(NO)参与对肾小球系膜细胞的调控作用。本文测定了肾小球肾炎患者尿中NO代谢产物的排泄，并对其临床意义作了初步讨论。

　　病例和方法

　　一. 病例选择

　　1.正常对照组

　　选择正常志愿患者30名，其中男性14名，女性16名，平均年龄41+8岁，无高血压、尿路感染和慢性肾脏疾病，无糖尿病史。

　　2.慢性肾小球肾炎组

　　选择交通大学医学院附属新华医院的门诊随访和住院的慢性肾小球肾炎患者，共58例，男性28例，女性30例，平均年龄43+7岁。其中有高血压34例，均有不同程度的血尿和蛋白尿，肾功能正常，48例有肾活检资料，系膜增殖性肾小球肾炎(MsPGN)17例，局灶性肾小球硬化(FSGS)15例，膜性肾病(MN)8例，轻微病变(MCD)8例。

　　二. 尿中NO代谢产物测定方法

　　1. 主要试剂

　　黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) Sigma公司

　　还原型辅酶Ⅱ(NADPH) Sigma公司

　　硝酸还原酶 Sigma公司

　　三氯乙酸 上海化学试剂厂

　　Griess试剂 (1%磺胺，0.1%萘乙烯二胺盐酸盐，5%磷酸)实验室配制

　　2. 标本收集方法

　　空腹取新鲜晨尿5ml，放入用三蒸水浸泡洗净的试管中，-200C冰箱保存备测肌酐和NO代谢产物。

　　3. 尿中NO代谢产物测定

　　参照Rosselli【1】和 Green【2】方法测定尿中NO代谢产物NOx-(NO2-+NO3-),

　　主要步骤如下：

　　(1)取500UI用三蒸水稀释5倍的尿液

　　(2)加入250uL底物缓冲液(0.1mol/L咪唑，210umol/L NADPH,3.8umol/L FAD,PH7.6)

　　(3)加250ul硝酸还原酶(1u/l)

　　(4)370C孵育45分钟，使No3-充分还原为No2-

　　(5)加入10%TCA250ul，充分混匀，12000转离心3分钟

　　(6)取上清1ml，加入1ml Griess试剂，室温置10分钟

　　(7)于722分光光度计525nm波长处比色，测值OD值。

　　(8)用硝酸钠配制不同浓度作标准曲线，根据标准曲线算出尿标本中NOx-含量.

　　4.肌酐测定方法用苦味酸法

　　三.统计方法

　　所有结果用均数+标准差表示，选用方差分析和t检验作统计检验。

　　结果

　　一.慢性肾小球肾炎患者尿中NO代谢产物排泄情况(表一)

　　从表一看出，慢性肾炎无高血压组尿中NO代谢产物与对照组比较，虽然降低，但无统计差异(p>0.05)，慢性肾炎有高血压组尿中NO代谢产物与对照组和无高血压组比较均明显降低(P<0.01)。

　　讨论

　　一. 尿中NOx-测定能否反映肾组织NO产生情况?

　　NO是无色透明的气体，体内NO的半衰期极短，约4秒钟，很快被还原成NO3-,NO3-进一步还原成NO2-，因此NO3-和NO2-为NO代谢的终产物，测定NOx-(NO2-和NO3-)的量,可以反映NO的产生情况，在人体内NOx-的量受到摄入食物的种类和量、胃肠道感染的影响，食物摄入影响可以用空腹避免，因此在无胃肠道感染的情况下，空腹血中NOx-的主要来源可能就是NO的代谢终产物。NOx-最终是通过肾脏排出，在肾小管有部分被重吸收，因此如用肌酐矫正尿中NOx-,即NOx-/Cr比值,可以反映体内NO产生情况【3】，如肾脏组织外的器官系统产生NO无病理变化，尿中NOx-/Cr比值可以反映肾组织内NO产生情况。

　　二. 慢性肾小球肾炎肾组织NO产生变化及其可能机制

　　至目前为止，尚未见到有关慢性肾小球肾炎肾组织NO产生情况的报道，有限的相关资料表明慢性肾小球肾炎肾组织内NO产生可能处于抑制或缺陷状态，Reyes【4】给肾大部切除大鼠补充NO的供体L-精氨酸，可明显提高GFR和RPF，延缓肾大部切除大鼠的进行性肾功能损害和组织学损害，提示NO对肾大部切除大鼠的肾功能有保护作用，我们对58例慢性肾小球肾炎患者尿中NOx-/Cr降低，按病理类型分组研究发现，MsPGN和FSGS患者尿中NOx-/Cr降低，但MN和MCD患者未见明显降低。

　　肾组织内肾小球系膜细胞，血管内皮细胞和肾小管间质细胞及浸润到肾组织内的单核—巨噬细胞，粒细胞等均可产生NO，且受到多种因素的调节，如L—精氨酸的量，细胞因子的调节等，另外NO合成酶是产生NO的关键酶，它的活性直接影响组织细胞产生NO的能力。在慢性肾小球肾炎，由于部分肾单位的毁损，使得产生L—精氨酸的能力降低，另外浸润到肾组织内的炎症细胞释放精氨酸，使精氨酸分解增加，共同结果是使得肾组织内L—精氨酸浓度降低，在慢性肾小球肾炎时，肾组织有些细胞因子表达降低，影响NO合成酶活性，使L—精氨酸转化为NO减少，慢性肾小球肾炎时毛细血管塌陷、闭塞，肾小球硬化，使有效毛细血管开放和血管内皮细胞减少，直接影响NO的产生等。上述这些因素可能共同导致了慢性肾小球肾炎肾组织内NO产生的不足。

　　三 慢性肾小球肾炎肾组织产生不足的可能病理意义

　　现已证实，NO可抑制肾小球系膜细胞增殖和产生细胞外基质，同时使金属蛋白酶活性升高，使基质降解增多【5】，NO可抑制血小板聚集和粘附功能，调节白细胞的趋化和粘附功能;NO介导血管舒张，使全身血压和肾小球内压介降低;NO还拮抗血管紧张素Ⅱ和内皮素对肾脏的病理作用;NO可调节肾小球系膜细胞收缩，从而影响超滤系数，调节GFR和RPF。因此如肾脏组织内NO产生不足，上述作用会降低，而这些因素却是肾脏疾病进展的主要因素，可以从理论上推测肾组织内NO产生不足对慢性肾小球患者肾功能的保护不利，这也许是其病理意义之一。

　　四 慢性肾小球肾炎患者尿测定可能的临床意义

　　慢性肾小球肾炎患者尿中NOx-/Cr是降低的，MsPGN、FSGS患者尿中NOx-/Cr也降低。慢性肾小球肾炎患者肾组织内NO产生不足将对其不利。因此我们可以推测给这些患者补充NO的供体L—精氨酸，可能对延缓肾功能损害，控制高血压有利。Reyes【4】的研究证实了这一点。但近来有报道，补充L—精氨酸有时无益反而有害。Narita【6】研究发现限制饮食中的L—精氨酸可以保护TGF—β诱导的肾小球硬化的肾功能。Okuda【7】同样发现急性肾小球肾炎鼠，限制L—精氨酸摄入可以降低TGF—β在肾组织内的表达，减少基质在系膜区的堆积，减少蛋白尿。但Narita和Okuda的研究均呈急性肾小球肾炎或此时肾实质无明显减少，肾组织内NO产生无不足，当明显肾小球肾炎进展，毁损肾单位越来越多，致使残留肾单位内高压和产生NO不足，此时补充L—精氨酸就会有利无害，而尿中NOx-/Cr不降低或反而升高，此时补充L—精氨酸就会有害。也许这是测定肾小球肾炎患者尿中NOx-/Cr比值的临床意义所在，当然初步结论有待进一步的临床研究。

　　参考文献

　　1.Rosselli M，Imthurm B，Macase E，et al.Circulating nitrite/Nitrate levels increase With follicular development indirect evidence for estraliol mediated No release Biochem Biophs Res Commun 1994,202:1543-1552.

　　2.Green Lc .Analysis Of nitrate and 15N-nitrate in biological fluids.Anac Biochem,1982,126:131-138.

　　3.GrabowskiPs.Elevated nitric oxide production in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheumatism,1996,39(4):643-647.

　　4.Reyes AA.Dietary Suoolementation With L-argininem eliorates the Progression of renal diseases in rats with subtotal nephrectomy.Am J kidney Dis,1992,20:168-176.

　　5.Trachtman H,Futterweit S,Singhal P,et al.Nitric Oxide modulates the synthesis of extracellular matrix proteins in culthred Rat Biochem Biophys Res Commun,1995,207(1):120.

　　6.NARITA I,WAYNE A,BORDER S et al L-arginine may mediate the therapeutric effeets of Low Protein diets,proc NatLA cad Sci,1995,92:4552.

　　7.Okuda S,WAYNE A,BORDE R,et al.Dietary Protein restriction rapidly reduces transforming growth factor betal expression in experimental glomerulonephritis Porc NatLA cad Sci.1991,88:9765.