ＨＥ染色原理和试剂配制及染色过程中的若干问题的探讨

　　【摘要】 目的 探讨HE染色原理和试剂配制及染色过程中的若干问题的临床基础性意义，推广优良、简捷、经济的试剂配制方法，研究染色过程中的若干问题， 完美HE染色，明确病理诊断，利于临床治疗。方法 采用本科室自己配制试剂所染HE切片30张和30张(对照组)某试剂公司配制试剂所染HE切片进行显微镜下对比 ，分析两者的优缺点及染色过程中的若干问题。结果 本科室自家配制试剂所染HE切片明显优于对照组，尤其体现在细胞核着色上，注重染色过程中的若干问题的切片比未注重染色过程中的若干问题的切片质量高。 结论 HE染色原理和试剂配制及染色过程中的若干问题的探讨，从基础理论出发，不断实践，为更完美、清晰地呈现显微镜下正常或异常的组织细胞结构，明确病理诊断，从而更好更快地指导临床治疗而努力 。

　　【关键词】 HE染色

　　在病理组织切片染色中，苏木素伊红(HE)染色是其最基本、最常用的一种染色方法，目前各种试剂公司HE染液层出不穷，购买方便，但价格昂贵、染色效果并不太理想。本科室二十多年来应用自己所配HE染色液，效果较好，近年偶然用了某试剂公司HE染液，结果效果次于前者，后也有其它试剂公司HE染液要求试用，结果效果也不太好，尤其在细胞核的显色上更明显，现将结果报道如下：

　　资料与方法

　　1、材料

　　选择2010年1月～2010年7月在江苏省人民医院病理科同一台染色机所做的本科室所配HE染色液所染病理切片30张;对照组30张为某试剂公司HE染液所染病理切片。这两组30张病理切片要求每组都含有皮肤、眼球、扁桃体、唇腺|、食道、胃、十二指肠、阑尾、乙状结肠、直肠、肝、胆囊、胰腺、脾、肾、膀胱、前例腺、睾丸、子宫、乳腺、甲状腺、肾上腺、鼻息肉粘膜、支气管粘膜、肺、骨髓、淋巴结、大网膜、二尖瓣、主动脉瓣的组织。同一组织选同一蜡块切两张相同厚度(4微米)片分别用本科室所配HE染色液、某试剂公司HE染液进行染色，然后显微镜下一一对应观察对比，以筛选出优质染液，推广优良、简捷、经济的试剂配制方法，研究染色过程中的若干问题，完美HE染色，明确病理诊断，利于临床治疗。

　　2、本科室HE染色液的配制方法：

　　备5000ml玻璃瓶(要求质量要厚实不易炸裂的)或大容量的瓷缸一个～若干个(根据需要而定);取5000ml玻璃瓶一个洗净,在5000 ml水位处用标签贴上标记线。取500g钾明矾(硫酸铝钾)投入此瓶内，并将瓶拎到开水间 100ºC水龙头下，瓶底下垫木板或木制脚凳;接100ºC水入瓶并用竹棒或木棒不断搅拌，这样边加水边搅拌至钾明矾完全溶解。然后向瓶内加入事先配好的250ml苏木素酒精溶液(将25g 苏木精粉末投入量杯并加入250ml 无水酒精，用玻棒调匀即可)，迅速用棒搅匀 ，液体呈暗深蓝色，然后再继续加100ºC开水至5000 ml水位标记线 ，用竹棒搅匀瓶内液体;待液体冷却后将瓶放置阳台，瓶口不加盖，也可在瓶口上蒙上薄薄一层纱布(纱布下緣用带子或皮筋扎紧)防过多灰尘入瓶，这样进行自然氧化约半年至一年左右，经自然氧化充分的苏木素染液液面可见荧亮色结晶层;使用前用滤纸或多层纱布过滤以滤除荧亮色结晶层、灰尘、细菌虫卵等，过滤后还可加适量冰醋酸或每100ml加冰醋酸 5ml(媒染以促进染色，使所染片子更好看)即可用

　　3伊红的染液的配制

　　首先用蒸馏水清洗量杯等器皿, 称水溶性伊红12.5g投入量杯加入量好的125ml蒸馏水搅拌均匀,并加适量的冰醋酸,用玻棒搅拌使液调成糊状，然后糊状液沿内附滤纸的漏斗过滤，待滤液滴净，将内附滤纸的漏斗放入烘箱内烘干滤纸上析出物(可过夜烘烤干，次晨取出)，将烤干的滤纸上析出物投入95 %5000ml酒精中搅拌均匀混合，因酒精易挥发，配好后加盖封存，且用塑料薄膜扎紧瓶口。

　　3.1醇溶性伊红(即乙醇伊红)染液配制方法：

　　先将醇溶性伊红Y25g溶于95%酒精5000ml中，用玻棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸(促染剂)1滴。用乙醇性伊红液染细胞浆后可不经水洗，直接用85%酒精脱水。

　　3.2分化液的配制：

　　<一>0.5%～1%盐酸酒精分化液的配制：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    （0.5%、0.1%的盐酸酒精分化液是常用的浓度）

 

此液用一段时间后需要延长或更换液体，新液分化时间要短。

 

   <二>1%～0.5%～0.25%盐酸水分化液的配制：

   （1%、0.5%、0.25%这三个浓度的分化液为常用的浓度剂量）可根据苏木素染液的深浅浓淡酌情灵活配制使用。

　　

 

 

 

 

三、HE染色步骤：

　　(一)、脱蜡

　　1、 二甲苯Ⅰ脱蜡10分钟左右(自动染色机染10分钟)

　　2、 二甲苯ⅡⅢ脱蜡5分钟左右(自动染色机染10分钟)

　　3、 无水酒精(乙醇)Ⅰ洗去二甲苯1分钟(机染1分钟)

　　4、 无水酒精(乙醇)Ⅱ洗去二甲苯1分钟(机染1分钟)

　　5、 95%酒精1分钟(机染1分钟)

　　6、 85%酒精1分钟(机染1分钟)

　　7、 自来水洗片刻(机染1分钟)

　　(二)、染色

　　1、 苏木素染色1～5分钟左右(机染1～5分钟)

　　2、 自来水洗片刻(机染1分钟)

　　3、 1%或0.5%或0.25%盐酸水分化3～5秒钟(机分化30秒)

　　4、 自来水洗，温水蓝化片刻(机洗5分钟)

　　5、 伊红酒精染液浸染20秒～2分钟(机染30秒～5分钟)

　　(三)、脱水、透明、封固

　　1、 85%的酒精脱水20秒(机染20秒)

　　2、 95%的酒精1分钟(机染1分钟)

　　3、 无水酒精Ⅰ染1～2分钟(机染2分钟)

　　4、 无水酒精Ⅱ染2分钟(机染2分钟)

　　5、 二甲苯Ⅰ浸2分钟(机染2分钟)

　　6、 二甲苯Ⅱ浸2分钟(机染2分钟)

　　7、 中性树胶或加拿大树胶封片 [2]

　　结果与讨论

　　染色结果:细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，钙盐和各种微生物也可染成蓝色和紫蓝色。细胞核蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒被伊红染成深浅不同程度的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

　　两组不同HE染色液染色结果比较:(如下表/图1、图2)

　　

 

由此可见本科室自家配制试剂所染HE切片明显优于对照组，尤其体现在细胞核着色上。因此 推广优良、简捷、经济的本科室自家试剂,以 完美HE染色，明确病理诊断，利于临床治疗。另外值得注意的是:注重染色过程中的若干问题的切片比未注重染色过程中的若干问题的切片质量高。 要完美HE染色除选择优良试剂，在HE染色中还应注意以下事项：

　　1、脱蜡 石蜡切片必须经过脱蜡后才能染色，脱蜡前切片要经烘烤，这种使组织和玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，所有的时间都是指新的二甲苯在室温25ºC以下时，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一 。

　　2、染色 石蜡切片经水洗后放入苏木素染色液中，一般情况下新配的苏木素染液中只需染一至三分钟左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。苏木素染色后，不易在分化液中停留时间过长，切片分化应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木素染液中染色，在水洗分化和使切片在自来水或稀的氨水中充分变蓝(蓝化)。

　　新配的伊红染色块，切片染色不易过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片使伊红染后，分化时间要短。

　　3、脱水 切片经过染色后，通过各级酒精脱水，首先从低浓度到高浓度，低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时要短，向高浓度逐渐延长脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。

　　4、透明与封片 石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片[3]。因引起注意的是：二甲苯纯度不纯使切片透明不够会影响切片质量!(工作中曾发现新进货的二甲苯试剂中散发出浓厚的汽油味，严重影响切片质量! )

　　总之， HE染色在基础医学研究和临床医学研究中都是不可缺少的 。随着江苏省人民医院病理科工作量的不断加大，每天数百例，一年数万例的病理标本经固定、脱水、包埋、切片，HE染色 制片后发出显微镜下病理报告，指导临床;HE染色在临床工作中显得尤为重要，且在现今不断增加的临床手术中快速冰冻切片(10～30例/日)中 ，完好的HE染色依然散发出其独有的魅力，体现其快的节奏。

　　[参考文献]

　　[1] 王环增.卫生专业技术资格考试指南[病理学专业(病理技术专业)][M].北京：知识出版社,2001.255-275