家兔疑核内P2X受体在急性低氧中的作用

　　作者单位：山东大学医学院生理学研究所， 济南 250012

　　【摘要】 目的 研究疑核(nucleus ambiguous，NA)处P2X受体在急性低氧中的作用。方法 实验采用电生理和微量注射相结合的方法，以膈神经放电为观察指标，观察呼吸变化。通过吸入10%氧气(10%O2，90%N2)引导出低氧外周化学感受性反射。在NA处分别微量注射P2X受体的激动剂三磷酸腺苷(ATP)和阻断剂磷酸吡哆醛(PPADS)，观察这些药物对急性低氧呼吸的影响。结果 吸入低氧混合气后，动物呼吸加深加快;在NA处微量注射ATP增强了急性低氧呼吸频率，微量注射PPADS部分阻断了ATP对低氧通气的兴奋效应。结论 NA处P2X受体对急性低氧通气反应具有一定的调节作用。

　　【关键词】疑核;P2X受体;呼吸

　　ZHANG Hui, ZHANG Minghua, LI Qin, CHEN Tingshun, ZHAO Qi, WANG Hui, YU Shu yan

　　(Institute of Physiology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To investigate the effects of P2X receptor in the nucleus ambiguous (NA) on acute hypoxic ventilation. Methods Experiments were performed on anesthetized, immobilized and artificially ventilated rabbits. The peripheral chemoreflex to hypoxia was elicited by ventilating the animals with 10%O2balance 90%N2. Changes in the peak amplitude and frequency of integrated phrenic nerve discharge were recorded. The ventilatory responses of the peripheral chemoreflex following microinjection within the NA of either P2X receptor agonist adenosine triphosphate (ATP) or antagonist pyridoxal5′phosphate6azophenyl2, 4disulfonate (PPADS) were observed. Results Excitation of the phrenic never discharge was induced by ventilating the animals with hypoxic mixed gases. Microinjection of ATP in NA increased the frequency of acute hypoxic respiration, whereas microinjection of PPADS partially blocked the respiratory effects of ATP microinjected into NA. Conclusion The present results suggested that ATP acting via the P2X receptor in the NA may be involved in the respiration control of the acute hypoxic ventilatory response.

　　Key words： Nucleus ambiguous; P2X receptor; Respiration

　　近年来的研究表明，P2X受体介导的嘌呤递质信号途径参与呼吸运动的调控。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)是内源性P2X受体激动剂。P2X嘌呤受体在疑核(nucleus ambiguous，NA)内亦有分布[1]668670。但是ATPP2X介导的嘌呤信号途径是否参与NA对呼吸运动的调控，目前鲜见报道。本研究通过向NA内微量注射P2X受体激动剂和阻断剂观察NA部位P2X受体在急性低氧通气中的作用，揭示NA内的P2X受体在急性低氧条件下，对呼吸运动的调控及其可能的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物

　　成年健康家兔12只，雌雄不拘，重2～2.5?kg，由山东大学实验动物中心提供。

　　1.2  实验步骤

　　乌拉坦麻醉(1?g/kg，iv.),气管插管，四碘季铵酚(2～3?mg/kg，iv.)肌松后，经气管插管接呼吸机进行人工通气。动物头部以俯卧位固定于立体定向仪(Narishige SN. 3型，Japan)上。暴露脑干背侧面闩部及第四脑室底。分离双侧膈神经，悬挂于双极银丝记录电极。膈神经放电输入AVB10生物电放大器(Nihon Kohden, Japan)放大，显示于VC.10双线记忆示波器(Nihon Kohden, Japan)。同时导入PCL.6024E数据采集卡，输入计算机后通过BioBench软件对信号进行记录、分析。

　　1.3  血压和血气的监测

　　整个实验过程中监测并记录股动脉血压。在给动物吸入10%氧气(10%O2, 90%N2)之前和期间的最后1?min，分别由股动脉插管处抽取1?mL的动脉血样进行血气分析(由山东大学齐鲁医院血气室检测)。

　　1.4  微量注射

　　1.4.1  注射药品

　　P2X受体激动剂ATP、P2X受体阻断剂磷酸吡哆醛(PPADS)，均购买于美国Sigma公司。以上药品均由1.9:1的人工脑脊液和二甲基亚砜溶解稀释至所需浓度。

　　1.4.2  注射部位和方法

　　将充入注射药物的玻璃微管内置一直径约10?μm的钨丝，尖端露出0.1?mm，用微电极推进器分别插入NA(闩前1～4?mm，中线旁开3～4?mm，背侧表面深入3～5?mm)，在引导出吸气神经元放电处进行微量注射。玻璃微管与0.1 Hamilton微量注射器(上海医用激光仪器厂)相连，用以微量注射。向NA微量注射ATP(0.2?mol/L, 50?nL)和PPADS(0.2?mol/L, 50?nL)，1?min内注射完。每只动物仅用于微量注射1～2次。NA中心区域等速度微量注射等渗的生理盐水溶液(pH 7.2)作为对照，以排除注射速度、渗透、pH等对实验结果的影响;在NA中心区域旁开1?mm处作区域对照注射。

　　1.5  组织学定位

　　实验完毕后，注射部位注射2%滂胺天蓝(0.1?μL)。静脉注射致死量乌拉坦(2?g/kg)处死动物，取脑，置于10%甲醛溶液中固定。两周后做40?μm厚的冰冻组织切片，光镜下鉴定注射位点(图1)。

　　1.6  统计学处理

　　膈神经放电积分(BioBench软件以每个呼吸周期膈神经放电为单位作积分)幅度和呼吸频率，均为吸入10%O2期间最后30?s内各膈神经放电积分幅度峰值和频率的平均值。计量数据输入SPSS10.0统计分析软件进行统计处理，以mean±SD表示。统计方法用配对t检验和F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结 果

　　2.1  急性低氧引起的呼吸反应

　　根据膈神经放电调节呼吸机的呼吸参数(呼吸频率50～80次/min;潮气量20～25?mL)。待动物呼吸平稳后，吸入气由常氧转换为10%O2、90%N2的低氧混合气体,持续5?min，诱导出外周化学感受性反射，导致呼吸兴奋。膈神经放电积分幅度和频率与前对照，即常氧状态相比均增加。低氧期间动物血压无明显变化，个别动物血压稍有升高(P>0.05)，均迟于膈神经放电的变化。动脉血气分析显示的各指标为：常氧期间pH值(7.2l3±0.003)，Po2(120±13)mmHg(1?mmHg=0.133?kPa)，Pco2(37.9±2.4)mmHg，HCO3 (19±1) mmol/L，剩余碱浓度(-9±1) mmol/L，氧饱和度(99±1)%，低氧期间pH值(7.282±0.004)，Po2(43±6) mmHg，Pco2(28.9±3.1) mmHg，HCO-3(14±1)mmol/L, 剩余碱浓度(-12±2)mmol/L，氧饱和度(79±3)%。

　　2.2  微量注射不同药物对常氧状态下膈神经放电的影响

　　向NA分别微量注射ATP(0.2?mol/L，50?nL)、PPADS(0.2?mol/L, 50?nL)、1.9∶1人工脑脊液和二甲基亚砜混合液50?nL，膈神经放电稍有波动，但差异无统计学意义(P>0.05)。向NA之外(NA旁开1?mm)、电刺激不引发呼吸效应的区域微量注射ATP(0.2?mol/L, 50?nL)，膈神经放电不发生显著性变化。

　　2.3  微量注射不同药物对急性低氧呼吸方面的影响

　　2.3.1  向NA微量注射P2X激动剂ATP

　　给动物持续吸入10%O2 5?min诱导出外周化学感受性反射。低氧期间呼吸频率逐渐加快，膈神经放电幅度也随之增高，以此为前对照。2?h后待动物已完全恢复到正常，向NA微量注射P2X激动剂ATP(0.2?mol/L, 50?nL)，5?min后再次吸入10%O2 5?min，低氧期间呼吸频率和膈神经放电积分幅度虽然均有所增加,与前对照相比，膈神经放电积分幅度较注射ATP前正常值增加(70.04±5.01)% (n=6, P<0.01)，放电频率加快(13.9±1.05)% (n=6, P<0.01)。然后膈神经放电积分幅度和放电频率逐渐恢复正常，微量注射ATP 30?min后，与注射前相比，无显著性差异(图2)。

　　向NA内微量注射ATP兴奋膈神经放电积分幅度和呼吸频率

　　Fig.2 Microinjection of ATP into NA of spontaneous breathing increased the integrated phrenic amplitude (∫phr)and respiratory frequency(f)

　　2.3.2  向NA微量注射P2X受体阻断剂PPADS

　　向NA内注射PPADS 50 nL后在同一位置注射ATP(0.2?mol/L，30?nL)，记录低氧时膈神经放电。结果显示注射前、注射PPADS 60?min前第一次注射ATP、注射PPADS后2?min、注射PPADS 5?min后第二次注射ATP、注射PPADS 25?min后第三次注射ATP和注射PPADS后60?min的膈神经放电见图3。实验结果表明，微量注射PPADS后5?min在NA内同一位点再次微量注射ATP(0.2?mol/L, 30?nL)所导致的低氧呼吸兴奋效应被部分阻断。

　　注射PPADS前首次向NA微量注射ATP 30?nL对低氧时膈神经放电有显著的兴奋效应，主要表现为放电积分增大，呼吸频率加快。放电积分幅度较注射前增加(30.28±6.12)%，呼吸频率加快(17.31±0.72)%(以上均为膈神经放电变化最大值)。微量注射PPADS后5?min，向NA内同一位点第二次注射ATP 30?nL，对低氧时膈神经放电仅引起轻度兴奋效应。放电积分幅度较注射前增加(7.51±3.49)%(n=6, P<0.05)，呼吸频率减慢(4.76±0.54)%(n=6, P<0.05)。与第一次注射ATP(注射PPADS前)相比，膈神经放电积分幅度兴奋程度降低(41.45±5.88)%(n=6, P<0.01)，呼吸频率兴奋程度降低(35.17±3.01)%(n=6, P<0.01)。微量注射PPADS后25?min，再次向NA内同一位点注射ATP 30?nL，对膈神经放电的兴奋程度与第一次注射ATP相比差异无统计学意义。放电积分幅度较注射前正常值增加(9.31±5.1)%(n=6, P<0.05),放电频率减慢(6.75±1.11)%(n=6，P<0.05)(图4)。

　　3  讨 论

　　本实验结果显示，向NA内微量注射P2X受体激动剂可以增强低氧时外周化学感受性反射的呼吸兴奋效应。微量注射P2X受体阻断剂可部分阻断ATP对低氧时外周化学感受性反射的呼吸兴奋效应。注射过程本身可能引起的局部压力、渗透压、pH值的变化，从而对NA产生非特异性的刺激。然而向NA内微量注射同等剂量、等pH、等渗透压的人工脑脊液，呼吸运动不发生显著性变化，这说明注射ATP的呼吸效应与那些非特异性刺激无关。另外，向NA以外、电刺激不产生呼吸效应的区域注射ATP后，动物的呼吸运动不发生显著性变化。这些结果说明，ATP作用于NA内的神经元，从而引起呼吸运动的变化。而两种药物对常氧下的呼吸活动也没有影响。该结果说明在NA处的P2X受体参与了低氧化学因素诱导的反射，而对常氧下的呼吸调控并不发挥作用。提示在NA控制呼吸活动的机制中,低氧时NA区P2X受体的表达可能与低氧时保持一定的呼吸频率有关。

　　ATP是P2X受体家族的内源性激动剂。一般认为，P2X受体家族包括7种受体亚型(P2X1至P2X7)，目前至少表达出了11种同源性或异源性的受体亚型[2]。以往免疫组织化学实验显示，NA内分布大量的P2X受体[1]668。P2X受体可位于突触前膜，也可位于突触后膜[3]。在NA中，ATP 与突触前膜的P2X 受体结合可导致谷氨酸释放增加，从而兴奋突触后神经元。P2X 受体是配体ATP门控的离子通道，当与胞外ATP结合时P2X通道打开，允许Na+、K+和Ca2+等阳离子通过[4]。因此，ATP与突触后膜P2X受体结合可导致神经元质膜去极化，提高神经元兴奋性。本研究推测，向NA微量注射ATP后，导致局部神经元兴奋性提高，从而引发了类似于电刺激的呼吸效应。

　　PPADS是一种广谱P2X受体拮抗剂。以往研究表明，多种P2X受体亚型可被PPADS阻断，但P2X4和P2X6两种亚型对PPADS不敏感。且P2X受体较P2Y受体对PPADS更为敏感[5]。本次研究结果显示，向NA内注射ATP导致的兴奋效应可被PPADS部分阻断。这一结果表明P2X受体参与了NA对于呼吸运动的调控。但是，即使注射大剂量的PPADS，注射ATP引起的呼吸效应也不能被全部阻断。分析原因可能为：NA中可能表达对PPADS不敏感的P2X受体亚型;或者ATP兴奋了其他类型的嘌呤受体(例如嘌呤1型受体，P2Y受体)。但必须注意到实验技术也存在一定的局限性。本研究结果表明，PPADS的作用很容易失效，并且其作用时间只能持续20?min。而微量注射PPADS后与第二次注射ATP之间有5?min的时间间隔，或者第一次注射ATP的呼吸效应还没有完全消失，这些均可能影响PPADS的阻断效果。

　　目前，人们越来越多地认识到，在参与各种生理机能的调控过程中，嘌呤信号传递系统与其它神经递质系统存在相互协同作用。例如，ATP和GABA是中枢神经系统内两种重要的神经递质。有研究发现，GABA受体和嘌呤能P2X2受体这两种离子通道之间存在相互作用[6]。这些研究结果均说明，中枢神经系统内嘌呤能信号传递系统和GABA能递质系统关系密切，相互协同。因而可推测，向NA内微量注射ATP后引起的呼吸效应可能由另一种机制介导，即P2XATP介导的嘌呤能信号传递系统和GABA能递质系统之间的协同作用。

　　P2X受体在延髓NA区的明显表达,为ATP对呼吸节律的调节提供了功能结合位点,为进一步深入研究在通气反应中,机体感受Po2、Pco2和氢离子浓度变化后,如何将信息传入呼吸中枢提供了一条新途径。

　　【参考文献】

　　[1] 马岩. P2X2和P2X4受体在新生和成年大鼠延髓的表达[J].复旦学报：医学版，2006,33(5).

　　[2] North R A. Molecular physiology of P2X receptors[J]. Physiol Rev, 2002, 82(4)：10131017.

　　[3] Ugel S, Schlichter R. Presynaptic P2X receptors facilitate inhibitory GABA ergic transmission between cultured rat spinal cord dorsal horn neurons[J]. J Neurosci, 2000, 20(6)：21212130.

　　[4] Aoki Y, Yamada E, Endoh T, et al. Multiple actions of extracellular ATP and adenosine on calcium currents mediated by various purinoceptors in neurons of nucleus tractus solitarius[J]. Nurosci Res, 2004, 50(3)：245255.

　　[5] Lambrecht G. Agonists and antagonists acting at P2X receptors: selectivity profiles and functional implications[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol， 2000, 362(45)：340345.

　　[6] BoueGrabot E, Toulme E, Emerit M B, et al. Subunitspecific coupling between gammaaminobutyric acid type A and P2X2 receptor channels[J]. J Biol Chem, 2004, 279(50):5251752525.