金银花醇提液对根管粪肠球菌生物膜作用体外研究
| 金银花醇提液对根管粪肠球菌生物膜作用体外研究 |
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发表时间：2011-5-30 0:40:27 来源：创新医学网医学编辑部推荐 |
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作者：许 颖，李德超，孙 剑 作者单位：(佳木斯大学附属口腔医院牙体牙髓病科, 黑龙江 佳木斯 154002) 【摘要】 目的：验证金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑制作用。方法：建立粪肠球菌生物膜体外模型，MTT法计算金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑菌率。并利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察药物对生物膜中粪肠球菌的影响。结果：金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑制作用随药物浓度增加而增加。CLSM观察见金银花醇提液可使粪肠球菌生物膜内活菌比例明显下降。结论：金银花醇提液对粪肠球菌生物膜具有一定抑制作用。 【关键词】 粪肠球菌;金银花;生物膜 Abstract：Objective：To verify antibacterial activity of the ethanol extractsof honeysuckle against E.faecalis.Methods：The E.faecalis mono-biofilm model invitro was established.After processed with ethanol extracts of honeysuckle，the inhibition rate of ethanol extracts of honeysuckle to E.faecalis mono-biofilm was calculated,and MTT assay was used.The effect of drugs on the E.faecalismono-biofilm was observed by using CLSM.Results：Inhibitory effect of ethanol extracts of honeysuckle to E.faecalis mono-biofilm increased with the drug concen tration. The results showed ethanol extracts of honeysuckle could decrease the vitality of E faecalis in the biofilm significantly by using CLSM.Conclusion：Theeffect of ethanol extracts of honeysuckle is obvious to inhibit E.faecalis mono-biofilm. Key words:E.faecalis;honeysuckle;biofilm 粪肠球菌在临床上很难清除，且能在根管治疗后根管中长期生存、繁殖、形成生物膜, 根管系统的复杂性使得单纯机械性预备不能够彻底根除根管内的细菌[1]。而生物膜的耐药性更是其难以清除的主要原因[2]。至今为止还没有一种理想药物用于控制粪 肠球菌生物膜感染。金银花是我国传统的中药植物,据研究表明金银花对多种肠道菌具有抑 制作用[3]，提示其可能存在抑制粪肠球菌的有效成份。目前有关该方面的研究尚未见报道，本研究以体外粪肠球菌模型为对象，验证金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑制效果。 1 材料和方法 1.1 材料 粪肠球菌(临床提取);金银花(河南封丘农科研究所);BHI液体培养基(友康基业生物科技有限公司);噻唑蓝 MTT(Sigma M2128，美国);碘化丙啶 PI(Sigma P4170，美国)。 1.2 方法 1.2.1 实验材料的制备 1.2.1.1 根管粪肠球菌获得和鉴定 采集病例为牙体牙髓病科门诊病人中根管治疗失败的单根管牙。以2%碘伏消毒牙体表面和髓室，用根管锉锉出根尖段的牙胶尖碎片和根管内壁玷污层，浸入装有4℃BHI液体的EP管中。所取样本迅速送检。CLED鉴定培养基培养过夜，根据CLED培养基说明中所述：直径0.5~0.8mm、淡黄色小菌落。挑取相应菌落，涂片革兰染色镜检。如为革兰阳性菌另取菌落做生化鉴定，并确定无其它菌后定为目标菌。 1.2.1.2 菌悬液的制备 将所获粪肠球菌接种于BHI平板培养基，37℃培养24h。挑取菌落至BHI液体培养基中制成菌悬液，比浊法调整细菌密度至6×108cells/mL备用。 1.2.1.3 金银花醇提液的制备 金银花经中药粉碎机打碎后过40目筛。取4g粉末，以50mL 60%的乙醇溶液浸泡至粉末完全浸透。上回流装置热回流提取1h，抽滤离心，收集残渣做二次回流，抽滤后合并滤液。经旋转蒸发仪真空旋蒸至稀膏状。4℃冰箱保存备用。 1.2.1.4 荧光染液配制 在避光条件下取碘化丙啶(PI)6mg，溶于10mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，配制成浓度为600μg/mL的储备液，4℃避光保存。使用前将PI储备液稀释成最终浓度15μg/mL的工作液。 1.2.2 金银花醇提液对粪肠球菌生物膜作用体外研究 1.2.2.1 实验分组 实验组(含金银花)：用超纯水以倍比稀释法将金银花醇提液配成浓度为：800mg/mL、400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL。阴性对照组：对粪肠球菌无抑菌能力的生理盐水。 1.2.2.2 不同浓度金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑制率 在96孔细胞培养板上建立粪肠球菌生物膜模型，每孔加入6.0×108cells/mL菌液50μL、BHI培养基150μL，封口37℃温箱培养24h。吸去96孔细胞培养板中菌液。按2.2.1实验分组加入药液100μL，37℃作用10min，无菌PBS小心冲洗去除药液。加入5mg/mL MTT，每孔10μL孵育4h后加入150μL DMSO溶液，摇床震荡10min，使结晶充分溶解。设调零孔(BHI、MT T、DMSO)，上全自动酶标仪测OD490nm吸光值。设阴性对照孔(无药物作用)，空白对照孔(BHI、MTT、DMSO)。测量OD490nm吸光值，取平均值。按下公式计算抑制率：抑菌率= (阴性对照孔OD值-实验组OD值) / (阴性对照孔OD值-空白对照孔OD值)×100(%)。 1.2.2.3 CLSM观察药物作用下粪肠球菌生物膜中细菌生存状态 将22mm×22mm无菌盖玻片放入6孔细胞培养板中，滴加6.0×108cells/m500μL菌悬液 至玻片表面，静置5min，沿培养孔侧壁小心加入5mLBHI培养基，封口37℃温箱培养24h，按照2.2.1实验分组加入药物，作用10min吸去药液，PBS小心冲洗。生物膜表面滴加PI染液200μL在37℃避光条件下染色15min，CLSM下观察。观察条件：PI最大吸收波长536nm，最大激发波长617nm。由生物膜与玻片相贴面向外逐层扫描，观察中间层与表层生物膜细菌。 2 结果 2.1 不同浓度金银花醇提液对粪肠球菌生物膜作用后，通过MTT实验测定吸光值并计算其抑菌率，见表1。随着所用药物浓度的增加抑制作用增强，800mg/mL金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的抑制率达到87.83%。各实验组与阴性对照组相比均有显著差异(P<0.05)。 表1 MTT法测得OD值及抑菌率 2.2 CLSM观察可见生物膜中死细菌在相应的激光激发条件下呈红色，重叠透射光影像即可观察到细菌在生物膜中的生存状态。与阴性对照组对比显示各浓度的金银花醇提液作用后生物膜内细菌均有死亡，并呈浓度依赖关系。表层细菌相对敏感，相同浓度药物作用后中间层死菌密度相对较小。25mg/mL浓度金银花醇提液作用后(图1)即可见生物膜表层出现大量死菌，400mg/mL金银花醇提液作用后(图2)表层大多数细菌灭活。800mg/mL金银花醇提液作用后中间层仍有一定数量细菌存活。图1 25mg/mL金银花醇提液作用后粪肠球菌生物膜表层细菌图2 400mg/mL金银花醇提液作用后粪肠球菌生物膜表层细菌图3 800mg/mL金银花醇提液作用后粪肠球菌生物膜中间层细菌 3 讨论 在体外建立粪肠球菌生物膜模型做为研究对象，观察金银花醇提液对粪肠球菌生物膜的作用效果。实验采用MTT法测定粪肠球菌生物膜细胞活性及对抗菌药物的敏感性。 MTT形成甲躜的量与反应活细胞数量成正比，通过酶标仪依颜色深浅可测定出吸光度值，既可间接定量地反映细菌的生长和存活状况，并可用于细菌对药物的敏感性测定[4]。PI是一 种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI不能穿人完整的活细胞膜中，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI穿过破损的细胞膜而对核染色。根据此特点，使用PI染色在激光共聚焦显微镜下可鉴别死细胞。通过图像对比发现经过不同浓度金银花醇提液处理后生物膜表层单位面积内的死菌所占比例不同，但细菌密度未见降低，提示生物膜表层的粪肠球菌死亡后并不会立即脱落。药物浓度但即使浓度高达800mg/mL也不能完全杀灭全部细菌，笔者认为可能有两方面原因：一是由于药物渗透性不强，二是药物中有效抑菌成份浓度不足。针对其有效成份进行精细提取还有待进一步研究。 【参考文献】 [1]葛兵.根管治疗后疾病与粪肠球菌[J].国际口腔医学杂志，2008,35(4):128131 [2]史巧,王红宁,刘立.细菌生物膜与耐药性相关性研究进展[J].2008,35(10):16331637 [3]王力川.金银花的化学成分及功效研究进展[J].安徽农业科学，2009,37(5):20362037 [4]Freimoser FM,Jakob CA,Aebi M,et al.The MTT assay is a fast arid reliable methodfor eolorimetric determination of fungal cell densities[J].Appl Environ Microbiol，1999,65(8):37273729 |