Egr-1对VSMC增殖、凋亡和表型转化的影响

　　【摘要】 目的：研究早期生长反应基因-1(Egr-1)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、凋亡和表型转化的影响。方法:实验分空白对照组和Egr-1组。应用MTT法研究不同浓度和不同作用时间组Egr-1对VSMC增殖的影响;应用透射电镜方法、原位DNA片段末端标记(TUNEL)方法，研究不同作用时间下Egr-1对VSMC表型转化与凋亡的影响。结果：MTT法检测不同浓度Egr-1组与对照组间比较OD值具有显著性差异(P<0.05)。浓度40μg/mL时促VSMC增殖效应最显著。在最适浓度下(40μg/mL)Egr-1促VSMC增殖作用于24h达到高峰。Egr-1抑制VSMC凋亡的作用在12h时最明显。对VSMC凋亡的影响在一定时间范围内呈负相关。Egr-1作用24h时促VSMC向合成表型转化的作用最显著。结论：Egr-1对VSMC的促增殖作用在一定范围内与浓度和作用时间呈正相关。Egr-1一定程度具有抑制VSMC凋亡的作用并促进VSMC由收缩型向合成型转化。

　　【关键词】 Egr-1;平滑肌;血管;增殖;凋亡;表型转化

　　Abstract：Objective:To investigate the effects of early growth respons gene-1(Egr-1) on the proliferation, apoptosis and phenotype transformation of vascular smooth muscle cell(VSMC).Methods：The VSMCs of the rat thoracic aorta were subcultured by the method of adherence. The third to eighth generation of cells was selected for the experiment. The experiment consisted of the control group and Egr-1 group. We applied the MTT method respectively to study the effects on th　　e proliferation of VSMC by Egr-1 at different concentrations and the different effect time. The method of transmission electron croscope and TUNEL were used to study the effect of Egr-1 with different effect time on phenotype transformation and apoptosis of VSMC.Results：There were significant differences in OD values tested by MTT assay at different concentrations of Egr-1 group compared with the control group,(P<0.05).Egr-1 showed the most significant effect on promoti　　ng VSMC proliferation when the concentration was at 40μg/mL.Atr the optimalconcentration(40μg/mL),the peak of VSMC proliferation promoted by Egr-1 was at 24　h.The most obvious action of inhibiting VSMC apoptosis by Egr-1 was at 12h. Theeffect of Egr-1 on VSMC apoptosis was negatively correlated within a certain time. When it was at 24h, Egr-1 played the most significant role in promoting converting to synthetic phenotype of VSMC.Conclusion：Promotion proliferation actionon VSMC by Egr-1 is positively correlated with the concentration and action time within a certain range. To some extent，Egr-1 has an effect on inhibiting VSMCapoptosis and promoting VSMC converting from contractile type to synthetic type.

　　Key words:Egr-1; smooth muscle; vascular; proliferation; apoptosis; phenotype transformation〖HT〗〖HJ*3〗

　　VSMC是构成血管壁中膜的主要细胞，其增殖、凋亡和表型转化是血管疾病和血管重建术后再狭窄等病理过程形成和发展中的重要因素。本实验通过利用体外培养VSMC，应用MTT法，原位DNA片段末端标记(TUNEL)法，透射电镜方法，动态检测Egr-1与VSMC增殖、凋亡和表型转化之间的关系，为血管疾病再狭窄的发生机制和防治提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　VSMC株,DMEM培养基，胎牛血清，Egr-1多克隆抗体，原位细胞凋亡检测试剂盒等。主要仪器：CO2培养箱，超净工作台，台式高速低温离心机，Thermo酶联免疫检测仪，细胞培养板，培养器皿等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 VSMC培养 采用贴壁法传代培养,选取3～8代细胞进行实验。

　　　　1.2.2 实验分组

　　①按不同浓度Egr-1对VSMC的影响分组：(1)空白对照组：用含10%的FBS的DMEM培养VSMC，不加任何其它试剂;(1)Egr-1组：培养液中加入Egr-1使其浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL和80μg/mL，每组均设8个复孔。37℃，5%的CO2培养箱中静置培养24h后终止培养。收集细胞检测。②按Egr-1作用时间对VSMC的影响分组：(1)空白对照组：处理同①;(2)Egr-1组：培养液中加入Egr-1为40μg/mL，分别于培养1h、6h、12h、24h和48h后，收集细胞进行测定。

　　1.2.3 MTT比色测定

　　按实验分组终止培养后进行MTT比色测定。在酶联免疫仪上490nm波长处测定光吸收值(A490值)，结果以OD值表示。

　　1.2.4 透射电镜观察 

　　细胞接种于25mm3细胞培养瓶中，调整细胞悬液密度为1×104个/mL，加入Egr-1抗体。1h、6h、12h、24h、48h后终止培养。取材，2.5%戊二醛固定1h，0.01MPBS漂洗3次，1%锇酸固定1h，室温下丙酮逐级脱水，包埋剂环氧树脂浸透，修块，制备超薄切片，柠檬酸铅染色10min，醋酸铀染色30min，透射电镜观察VSMC表型转化。

　　1.2.5 原位细胞凋亡检测 

　　调整细胞密度至1×104个/mL，细胞单层贴壁铺满细胞玻片，更换培养液，加入Egr-1抗体。按实验设计时间培养。4%多聚甲醛(pH7.2)固定15min，PBS漂洗5min×3次，0.1%TrionX-100渗透，滴加TdT及DIG标记的dUTP反应混合液，PBS漂洗5min×3次，酶标反应，DAB显色，水洗，伊红复染，树胶封片。普通光学显微镜下观察凋亡细胞情况：细胞呈棕黄色颗粒的VSMC为阳性细胞。

　　1.3 统计学处理

　　统计数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以(x[TX-]±s)表示，组间比较用单因素方差分析和LSD-t检验。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度Egr-1对VSMC增殖的影响 

　　见表1。不同浓度Egr-1对VSMC增殖的影响不同，在一定范围内，其作用强度与Egr-1浓度呈正相关。[FL)]　　表1 不同浓度Egr-1对VSMC增殖的影响

　　2.2 不同作用时间Egr-1对VSMC增殖的影响 

　　见表2。Egr-1在浓度为40μg/mL时对VSMC促增殖的效应最明显。其中24h组OD值达到高峰，显示Egr-1对VSMC的促增殖作用在一定范围内与作用时间呈正相关。表2 不同作用时间下Egr-1对VSMC增殖的影响L(2K2〗2.3〖KG*3〗不同作用时间Egr-1对VSMC表型转化与凋亡的影响 见表3。经Egr-1处理VSMC后，V　SMC细胞器含量明显增加，而肌纤维含量较少，细胞由收缩表型向合成表型转化。Egr-1 24h组促VSMC合成表型转化的作用最显著。结果表明Egr-1在一定时间范围内影响VSMC表型转化，促使VSMC由收缩型向合成型转变，有利于增强VSMC的分泌与合成功能。实验结果显示，VMCTunel阳性细胞核呈棕黄色，12h组对VSMC凋亡影响最显著，Egr-1对VSMC凋亡的影响在一定范围内与作用时间呈负相关。表3 不同作用时间Egr-1(t/h)对VSMC表型转化与凋亡的影

　　3 讨论

　　Egr-1作为一种调控因子在体外具有促培养的VSMC增殖的作用，在一定浓度和时间范围内，呈时间和剂量依赖性地促进VSMC增殖。在动物移植静脉的实验研究结果显示，移植后4周是移植静脉中VSMC增殖、内膜增生的高峰时期，Egr-1mRNA的表达也处于高峰，Egr-1蛋白在移植后2h即出现表达，说明Egr-1与VSMC增殖关系密切，在病理因素下这对细胞的损伤修复起重要作用。Clowes AW等[1]对球囊损伤的大鼠颈动脉研究发现，损伤后直至12周VSMC出现持续较高　　水平的细胞增生率,这种持续高水平的细胞增生反应会导致细胞数量增加30%，但实际上在12周时VSMC的总数与2周时测得的总数相比没有变化。Durand等[2]对动脉粥样硬化的新西兰兔行股动脉血管成形术，发现损伤处细胞凋亡率与最终血管内膜增生及再狭窄的发生呈负相关。本次实验观察到，不同作用时间Egr-1对VSMC凋亡的影响在一定范围内随作用时间延长而有显著变化，呈负相关。Egr-1作用12h时抑制VSMC凋亡作用最明显，具有显著的促进VSMC增殖、抑制VSMC凋亡的作用，这与既往的动物实验研究结果相一致。VSMC表型转化是高血压、动脉粥样硬化和血管成型术后再狭窄等心血管疾病病理过程中VSMC增殖和迁移的关键性起始步骤，是该类疾病共同的发病基础，主要表现为VSMC从收缩型转变为合成型，并获得增殖、迁移和合成、分泌大量细胞外基质的能力，是导致血管重塑的关键因素之一。本次实验观察到，正常体外培养成熟的VSMC粗面内质网和高尔基复合体等细胞器含量较少，而肌纤维含量较丰富，收缩型占优势，细胞处于分化状态。经Egr-1处理VSMC后，VSMC细胞器含量明显增加，有较丰富的线粒体和内质网，而肌纤维含量较少，且胞浆内可见空泡，细胞向合成表型转化。说明细胞合成和分泌功能增强。Egr-1在一定时间范围内促VSMC向合成型转变的作用。Egr-1对VSMC增殖、凋亡与表型改变的影响是导致血管壁重塑、血管再狭窄的关键因素。本研究揭示了Egr-1可作为干预靶点治疗以VSMC增殖为发病核心环节的心血管疾病提供新的思路和实验基础。

　　【参考文献】

　　[1]Murie-Luce BP，Gabbiani F， Fedard M,et al.Apoptosis participates incellularity regulation during rat aortic intimal thickening[J].AM J Pathol,1995，146(5):10591064

　　[2]Durand E,Mallat Z,Addad F,et al.Time courses of apoptosis and cell proliferation and their relationship to arterial remodeling and restenosis after angioplasty in an atheroscle-rotic rabbit model[J].J Am Coll Cardiol,2002,39(18):16801685