AT1R基因A1166C多态性与非酒精性脂肪性肝炎关系的研究

　　【摘要】 目的：研究血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R)基因A1166C多态性与日本高知地区非酒精性脂肪性肝炎(NASH)易感性的相关性，从基因学角度探讨NASH的发生发展机制，为NASH的预防、诊断和治疗提供一定的理论依据。方法：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-PFLP)方法对日本高知地区96例NASH患者和150例正常人AT1R-A1166C基因多态性进行分析。结果：NASH病例组A等位基因频率与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。NASH病例组AA基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论： AT1R-A1166C基因多态性与NASH的发生发展尚未显示相关。

　　【关键词】 血管紧张素Ⅱ1型受体;非酒精性脂肪性肝炎;单核苷酸多态性;血管紧张素Ⅱ

　　Abstract： Objective：To investigate the relationship between genetic polymorphism in angiotensin Ⅱtype 1 receptor (AT1R) and NASH in Japanese Kochi area to study the mechanism of NASH in gene and supply the foundations for prevention, diagnosis and therapy.Methods：In 96 patients with biopsy-proven NASHand150 healthyvolunteers, the genetic polymorphisms in angiotensin Ⅱtype 1 receptor (AT1R-A1166C) were determined by polymerase chain reaction(PCR) and restriction fragmentlength polymorphism(RFLP).Results：The A-allele and AA-genotype of the AT1R-A11　66C polymorphism showed no significantly difference in genotype distribution inNASH patients than in healthy volunteers(P>0.05).Conclusion：The polymorphismof AT1R- A1166C of angiotensin Ⅱtype 1 receptor has no correlation with NASH.Key words:angiotensin Ⅱtype 1 receptor (AT1R); nonalcoholic steatohepatitis (NASH); SNPs; angotensinⅡ〖HT〗〖HJ*2/5〗

　　非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steato-hepatitis，NASH)是一种以肝细胞广泛脂肪变性和炎症为特征的遗传-环境-代谢相关的临床病理综合征，其作为非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)发展过程的中间环节，是单纯性脂肪肝发展为肝纤维化，甚至是肝细胞癌的必经病理阶段。近年来，随着人们生活水平的逐渐提高，饮食结构也发生了相应变化，致使肥胖、糖尿病及高脂血症的发病人数逐年增多，NASH的发病率也相继上升，且发病年龄趋于年轻化。因而，NASH引起了人们的广泛关注[1]。单核苷酸多态性(SNPs)是指染色体基因组DNA特定的核苷酸位置上单个核苷酸变异引起DNA序列的多态性，在人群中发生频率大于1%[2]。其主要形式包括单碱基的转换、颠换、插入、缺失等。目前，对于NASH的SNPs研究的相关报道较少，主要是针对NAFLD的基因多态性进行的研究。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　①研究对象：收集日本高知大学附属医院第一内科患者及体检中心病例共246例。其中NASH病例组AT1R检测者为96例(男54例，女42例，平均年龄45.2±14.8岁);正常对照组150例(男83例，女67例，平均年龄47.1±15.6岁)。②主要试剂：全血DNA提取试剂盒购自美国Qiagfn公司;Taq PCR Mix试剂盒、限制性核酸内切酶Dde I购自日本TaKaRa公司;PCR引物由日本北海道Sequence株式会社合成纯化。

　　1.2 方法

　　①全血DNA提取：全血DNA的提取参照试剂盒说明书进行。②PCR目的基因扩增：PCR引物参照有关文献设计[3]。总反应体系为18μL，包括1μL DNA模板，9μLTaq PCR Mixture，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，7μL超纯水。上游引物序列：5’-AGAAGCCTGCACCATGTTTTGAG-3’;下游引物序列：5’-CAACAAGACAAAGCAAAGCC-3’。 PCR扩增循环参数为：94℃变性10min，94℃ 30s、退火温度为52.1℃ 30s、72℃ 180s，循环35次，72℃ 2min;扩增产物片断长度为230bp。③PCR产物琼脂糖电泳：制作3%TAE琼脂糖凝胶，取5μL PCR产物与1μL 6X loading buffer混合，加样，电压为100V，电泳15min。凝胶成像系统紫外灯下观察并保存。④PCR产物RFLP：PCR产物采用限制性内切酶DdeⅠ酶切，反应体系为15μL，包括PCR产物3μL、DdeⅠ酶0.3μL、10x Buffer 1.5μL、灭菌蒸馏水10.2μL;酶切片段长度为118bp和112bp。充分混匀后，37℃水浴过夜，3%TAE琼脂糖凝胶电泳，条件同上。

　　1.3 统计学分析

　　采用直接基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。检测结果均由SAS统计软件进行统计学分析处理。多组间计数资料比较采用χ2检验。相对危险度和相关分析采用软件包的比值比(odds ratio, OR)P<0.05具有显著差异性。

　　2 结果

　　96例患者与150例正常者均可检测到目的基因，基因型分布符合Hard-Weinberg平衡检验及卡方检验，片段长度为230bp。应用限制性内切酶DdeⅠ对PCR扩增产物酶切后琼脂糖电泳可检测出三种基因型：AA(仅出现230bp一个条带)，AC(出现230bp和118bp&112bp重合两个条带)，CC(仅见118bp&112bp重合条带)。NASH病例组A等位基因频率及AA基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义。〖HT6SS〗图1 AT1R基因酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果〖HT5”SS〗　〖HT5”，6”H〗表1 NASH病例组和正常对照组AT1R-A1166C等位基因及基因型分布

　　3 讨论

　　非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作为NAFLD发展过程的中间环节，是单纯性脂肪肝发展为肝纤维化，甚至是肝细胞癌的必经病理阶段。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)不仅能够维持正常血压和调节水盐代谢，而且也是细胞生长、增殖和器官、组织损伤后修复以及纤维化形成的重要调控因子。有研究发现[4]，应用血管紧张素受体拮抗剂可有效治疗NASH。肥胖特别是内脏脂肪的增加能够激活脂肪组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)并促进其表达，致使大量AngⅡ生成而使前脂肪细胞分化成熟受到抑制，促使成熟的脂肪细胞肥大增生，导致更多的AngⅡ被分泌而形成恶性循环。如此反复，脂肪组织分解加强，使血中游离脂肪酸(FFA)水平升高，致使过多的FFA在肝脏蓄积，可能是导致NASH患者肝脏脂肪变的原因。AngⅡ还可通过激活PKC及p38MAPK途径使核转录因子(nuclear factor kappa-B, NF-κB)被激活而促进炎症的发生;并通过激活HSC及抑制其凋亡以及增加ECM的合成和抑制其降解而促进肝纤维化的发生。

　　AngⅡ的生物学作用要与AT1R结合后方能实现。AT1R基因定位于3q21-25，其编码区全部位于一个长约2200bp不含内含子结构的单个外显子编码的片段上。AT1R基因的非编码区(3’-UTR)第1166位点腺嘌呤(A)可突变为胞嘧啶(C)即AT1R-A1166C后，可通过调控mRNA转录或翻译而影响AT1R的功能，进而影响机体对AngⅡ的敏感性。我们通过研究AT1R-A1166C基因多态性与非酒精性脂肪性肝炎的关系，确定该位点与疾病的发生是否相关联，为临床预防、诊断及个体化治疗提供一定的理论依据。本实验通过对比NASH患者基因型与正常对照组基因型，得出NASH病例组A等位基因频率及AA基因型频率与正常对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。这表明AT1R-A1166C基因多态性在NASH患者与正常人基本相似，与疾病的发生发展关系不大。这与薛建波等对于该位点与乙型肝炎肝硬化关系的研究结果基本相同[5]。但Sookoian[6]等对于肝硬化治疗的研究中发现AT1R-A1166 C基因多态性与肝硬化患者门静脉血液动力学密切相关。其相关性与本实验不同，可能与种族和地域的差异有关。本实验NASH患病组和正常对照组皆为日本人，与薛建波等对中国人研究的基因型分布基本类似。关于AT1R-A1166 C基因多态性与NASH的分析目前研究者较少，应增加样本量和种族类别进行综合分析比对。

　　【参考文献】

　　[1]Yoshiike N, Lwin H. Epidemiological aspects of obesity and NASH/NAFLD in Japan[J].Hepatol Res,2005,33(2):7782

　　[2]姚华, 李玉华,朱滨，等.非酒精性脂肪性肝病相关基因的单核苷酸多态性研究[J].论著癌变畸变突变,2006,5：230233

　　[3]Lieberman J, Sastre A. Angiotensin converting enzyme activity inpostmortery human tissues [J]. LabInvest,1983,48(6):711

　　[4]Kim S, Soltani-Bejnood M, Quignard-Boulange A, et al. The adipose Renin-Angiotensin system modulates systemic markers of insulin sensitivity and activates the intrarenal Renin-Angiotensin system [J]. J Biomed Biotechnol, 2006, 2006(5):27012

　　[5]薛建波,林懋惺,杨丽，等. 血管紧张素转换酶及血管紧张素Ⅱ1型受体基因多态性与乙型肝炎肝硬化的关系[J]. 临床荟萃, 2009,24(8):661665

　　[6]SookoianS, Castano G, García SI, et al.All66C angiotensin II type1 receptor gene polymorphism may predict hemodynamic response to losartan in patients with cirrhosis and portal hypertension[J]. Am J Gastroenterol，2005,100(3):636642