rhG-CSF对新生鼠缺氧缺血性脑损伤HIF-1α表达的影响

　　【摘要】 目的：探讨重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)对缺氧缺血性脑损伤新生鼠海马区及皮质HIF-1α(hypoxiainducible factor 1α)表达的影响。方法：将7日龄新生Wistar大鼠随机分成假手术组，HIBD组和rhG-CSF治疗组。在乙醚麻醉下行右侧颈总动脉结扎,氮氧混合气缺氧2.5h制备HIBD模型。应用免疫组织化学法检测HIF-1α。结果：免疫组化结果显示：在新生大鼠大脑皮层和海马区，HIBD组较假手术组HIF-1α表达明显增加(P<0.01),治疗组较HIBD组HIF-1α表达明显增加(P<0.01)。结论：缺氧缺血性脑损伤后，脑组织HIF-1α表达增加，可能与促进血管形成及抑制神经细胞凋亡有关。rhG-CSF可能通过调节HIF-1α的表达，减少神经细胞凋亡，增强脑组织对缺氧的耐受，从而改善缺氧缺血性脑损伤小鼠的预后。

　　【关键词】重组人粒细胞集落刺激因子;低氧诱导因子-1α;缺氧缺血性脑损伤;凋亡

　　Abstract：Objective：To investigate the effects of rhG-CSF on the HIF-1a expr　ession in hypoxia ischemia brain damage(HIBD) in neonatal rats.Methods：The Wistar rats, aged 7 days, were divided into Sham-operation group, HIBD group and rhG-CSF group, respectively. The rats of the HIBD group were anesthetized with ethylether. The right common carotid artery was exposed and ligated. Then, they were exposed to hypoxia in a normobaric chamber for 2.5h.The HIF-1αprotein expression was detected by immunohistochemistry.Results：The HIF-1a expression of the　HIBD group was increased compared with that of the sham-operation group(P<0.01).The HIF-1αexpression of the rhG-CSF group was obviously increased comparedwith that of the HIBD group(P<0.01).Conclusion：The up-regulation expression ofHIF-1α may be involved in suppressing apoptosis, and rhG-CSF may enhance the tolerance of the brain tissue to hypoxia and reduce apoptosis possibly by regulating HIF-1αexpression level, suggesting that rhG-CSF can improve prognosis of HIBD rats.

　　Key words:：recombinant human granulocyte colony-stimulating factor; hypoxia inducible factor 1α; hypoxia ischemia brain injury; apoptosis

　　目前，新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxia ischemia braindamage, HIBD)仍是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因。临床治疗仅采用对症处理、营养支持及早期干预等综合方法，目前国际上无公认有效方法。研究发现,在HIBD时缺氧引起的凋亡是由缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)和其他许多因子共同调节。HIF-1是一种氧调节蛋白,在缺氧条件下它与相应的靶基因结合,通过转录及转录后的调控，维持机体氧平衡。G-CSF是骨髓干细胞强有力的动员剂，G-CSF动员的CD+34细胞能够从循环血迁移至大脑缺血区。G-CSF体外培养能够激活神经元的抗凋亡通路，抑制神经元凋亡[1]。本实验通过建立新生鼠HIBD模型,探讨rhG-CSF对HIF-1α表达的调控作用，从而研究rhG-CSF治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的相关机制，为临床治疗提供一定的理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验分组及动物模型的建立　

　　选用佳木斯大学动物实验中心提供的健康7日龄Wistar大鼠70只,雌雄不限,体重10~14g,将大鼠随机分为假手术组10只;HIBD组和rhG-CSF治疗组,每组30只。模型组:大鼠乙醚麻醉后,仰卧位胶布固定,取颈正中切口,分离右侧颈总动脉,用0号线结扎,1号线一次性缝合切口。1h后放入自制密闭缺氧箱中,充以氮氧混合气(92%氮气、8%氧气)2.5h。麻药苏醒后返　回母鼠身边继续喂养。假手术组:分离右侧颈总动脉,不结扎,缝合切口,不做缺氧处理。治疗组:造模成功后,给予rhG-CSF50μg/kg腹腔注射,每日一次。重组人粒细胞集落刺激因子(瑞血新)购自深圳新鹏生物工程有限公司。

　　1.2 标本采集及免疫组织化学检测

　　分别于6、12、24h,3d及5d取各组动物乙醚麻醉,心脏灌注20mL生理盐水，待流出液澄清，用4%多聚甲醛进行内固定,开颅取脑。于4%多聚甲醛、4℃固定24 h,脱水透明后石蜡包埋，于前囟前0.3mm至前囟后0.6mm连续切片,片厚5μm备用。标本采用免疫组化S-P法,一抗采用兔抗大鼠HIF-1α抗体(Santa Cruz公司,美国),工作浓度1∶50;4℃孵育过夜。加生物素标记的抗兔IgG抗体(1∶100)孵育30 min,TBS液洗3次,加生物素/亲和素系统孵育30min。DAB显色,阳性为细胞核或细胞质中出现棕黄色细颗粒。阴性对照用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，不出现阳性反应,说明一抗特异性强。阳性结果判定:取假手术组、HIBD组和rhG-CSF治疗组各时间点免疫组化切片各3张。光学显微镜下观察大鼠海马区和皮层，取同一批次染色切片3个相应、不重复的视野,放大400倍，计数每个视野中阳性细胞数,取其平均值[2]。参照Birnerl[3]的方法，综合阳性细胞占总细胞数的半分比和染色强度进行半定量处理。阳性细胞占细胞总数的11%～50%为2分，51%～80%为3分，80%以上为4分;染色强度评分：着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者为3分。上述二项评分相加，不管其染色强度，只要阳性细胞数小于10%者为(-);2~3分为(+);4~5分为();6~7分为()。

　　1.3 统计学处理　

　　采用SPSS 10. 0统计学软件进行分析，各组阳性率比较用χ2检验，P<0.05判为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　缺氧缺血性脑损伤时HIF-1α表达增强，主要分布于海马区及大脑皮层，尤以血管内皮细胞显著。假手术组有极少HIF-1α表达，各时间点比较无统学意义(P>0.05)。HIBD组、治疗组HIF-lα表达明显增多(P<0.01);HIBD组HIF-1α阳性表达率为70.4%，治疗组HIF-1α阳性表达率为91.1%。治疗组HIF-1α的阳性表达率均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。表1 各组大鼠脑中HIF-1α的表达

　　3 讨论

　　核转录因子HIF-1是低氧诱导因子蛋白家族(HIFs)中维持细胞氧稳态的主要分子，由一个β结构性亚基和一个α功能性亚基构成，α亚基的表达有赖于细胞内的氧浓度。低氧条件下,HIF-1可诱导PI3K/Rho/ROCK途径激活c-myc，使其与myc-max反应元件结合，促进VEGF转录从而促进血管形成;还可促进GLUT-1, ENO1,EPO等基因的表达,抑制凋亡。Baek等[4]发现VEGF是缺氧时HIF-1最重要的靶基因之一。研究表明，HIF-1α缺失可导致VEGF表达下降,抑制肿瘤新生血管的形成，降低细胞对缺氧的耐受性，增加细胞凋亡[5,6]。本研究发现各时间点模型组HIF-1α阳性表达均高于假手术组,海马及皮质区尤其是血管内皮细胞表达明显增强。神经元在海马及皮质区分布较集中，对缺氧缺血较敏感。缺氧缺血脑损伤后，通过增加HIF-1α的表达，激活PI3K/Rho/ROCK途径，促进VEGF转录，促进血管形成，使细胞、组织对低氧环境发生适应性和保护性改变，抵抗细胞凋亡，为神经修复提供条件。rhG-CSF是一种应用生物工程技术生成的造血生长因子，生物学活性与天然的G-CSF相同。G-CSF通过与其特异性受体粒细胞集落刺激因子受体(granulocyte colony-stimulating factor receptor,G-CSFR)结合发挥作用。研究表明，G-CSF及其受体G-CSFR在神经系统海马CA3区、齿状回门区、室下区等多个脑区均可表达，且在缺氧缺血状态下表达明显增加。大鼠脑缺血后应用rhG-CSF治疗，凋亡细胞减少了70%[7]。张子强等[8]对急性脑缺血损伤大鼠应用G-CSF，动员自体骨髓血管内皮祖细胞促进血管新生，结果证实缺血坏死区新生毛细血管数目动员组明显多于非动员组。本实验中rhG-CSF治疗组HIF-1α表达阳性率较模型组均增加,且高峰持续时间较模型组延长。HIF-1α在海马及皮质区血管内皮细胞中表达更明显。提示rhG-CSF可能通过增加HIF-1α的表达作用于一系列靶基因，促进血管生成、神经分化，抑制神经细胞凋亡，对神经损伤起到保护及修复作用。

　　【参考文献】

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