糖尿病动物模型研究进展

　　作者：谢宁，吴颂，王晓博，关慧波，侯淑峰 作者单位：黑龙江中医药大学中医基础理论教研室，黑龙江 哈尔滨 150040

　　【摘要】 综述糖尿病动物模型研究进展，并对目前科研中常用的糖尿病动物模型制备方法、机制进行综述，并简略评价其优缺点。目前国内外糖尿病动物模型的制备方法很多，各有其特点，大体可以分为实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病模型等。其研究的不断进展，为深入探讨糖尿病病因、病机及其药物治疗提供了借鉴。

　　【关键词】 糖尿病;模型;动物

　　Advancement in diabetes animal models

　　XIE Ning，WU Song，WANG Xiaobo，et al

　　Department of Chinese Medicine Basic Theorise,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China

　　Abstract: To summarize the advancement of diabetes animal models，and the preparation methods and mechanism of diabetes animal models.The advantage and disadvantage of each method were reviewed respectively.There were many methods in establishing the induced animal models of diabetes with their own characters individually now.The animal methods of diabetes mellitus currently available have two categories:experimental diabetes animal model and spontaneous diabetes animal model.The research progress on animal models of diabetes mellitus could facilitate the further exploration on the etiology，pathogenesis and drug therapy of diabetes mellitus.

　　Key words: diabetes;models;animal

　　目前国内为研究人类糖尿病的预防与治疗，通过多种方法获得糖尿病的模型动物，自Minkowshi 等用切除狗胰腺的方法建立糖尿病动物模型已经有多年的历史，目前糖尿病动物模型通常分诱发性和自发性2类，主要用于药物筛选、病理改变等方面研究[1]。

　　1 实验性糖尿病动物模型

　　1.1 化学试剂诱发糖尿病

　　1.1.1 四氧嘧啶

　　能选择性破坏多种属动物的胰岛β细胞，引起实验性糖尿病。将四氧嘧啶(Alloxan)用生理盐水新鲜配制成浓度为1%～3%溶液，实验大鼠空腹12 h尾静脉1次注射40 mg·kg-1，血糖值可出现3个时限变化，注射后2～4 h为初期高血糖相，约6 h左右为低血糖，12 h后出现持续高血糖伴多饮、多尿等，并且血糖达16.7 mmol·L-1以上，稳定2周后可作为成功模型，造模最初成功率约85%;最终成功率约60%[2]。或腹腔1次注射新鲜配制Alloxan溶液100～120 mg·kg-1，24 h后血糖值≥16.7 mmol·L-1持续2周以上可选用[3]。绝大部分呈永久性高糖状态，但部分动物在3周内可自然缓解。以上方法常用于制备胰岛素依赖性糖尿病(insulindependent diabetes mellitus,IDDM)动物模型，但大剂量的Alloxan可致动物酮症酸中毒而死亡[4],以及肝、肾组织中毒性损害。因此,使用Alloxan制备糖尿病模型时要严格控制剂量[5]。

　　1.1.2 链尿佐菌素

　　链尿佐菌素(streptoxolocin，STZ)是一种药效强大的烷化剂,能干扰葡萄糖的转运，影响葡萄糖激酶的功能，诱导DNA双链的断裂[6]。(1)速发型:1次足量给予大鼠STZ，造成β细胞大量损伤，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，导致糖尿病。将STZ用0.1 mol·L-1枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成浓度为0.25%，pH4.2的溶液。大鼠禁食10 h，按50 mg·kg-1腹腔内1次注射STZ溶液，24 h内血糖≥16.8 mmol·L-1，稳定5 d即为成功模型[7]。此法较适于非胰岛素依赖性糖尿病(noninsulindependent diabetes mellitus,NIDDM)相关研究。(2)迟发型：福氏完全佐剂,可激发机体免疫功能。大鼠第1天腹腔注射0.5mL CFA，次日按25 mg·kg-1腹腔内注射STZ溶液。每周1次，连续3周，第3周成模型率可达87.5%[8]。此方法有免疫学的改变，更接近人类IDDM的发生发展变化。(3)STZ联合高脂饮食:先以高糖高脂饲料(10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇)喂养大鼠1个月，诱发出胰岛素抵抗，继以低剂量链尿佐菌素(STZ 25 mg·kg-1，以pH4.2的0.1 mol·L-1枸橼缓冲液配成0.25%浓度)[9]。该模型具有中度高血糖、高血脂、高血压、血胰岛素不低、胰岛素抵抗、成功率高等特点，多用于评价治疗NIDDM糖尿病的药物疗效。此模型缩短了造模时间，而且病理生理改变符合人类NIDDM。(4)AlloxanSTZ联合给药：既能降低单用Alloxan对肝、肾的损害,又弥补单用STZ剂量过大而致动物死亡或剂量过小而致成模率低的不足。注意的是2药诱导后10 h左右可出现急性低血糖反应，故给药后应在第8 h、10 h、13 h经皮下注射补充一定量的葡萄糖，以防发生致命的低血糖。Alloxan和STZ用50 mmol·L-1无菌枸橼酸钠缓冲液(pH=4.5)分别配成200 mg·mL-1和120 mg·mL-1的溶液。禁食24 h后氯胺酮麻醉下行股静脉穿刺，留置导管，经导管分别注入上述浓度的Alloxan 50 mg·kg-1和STZ30 mg·kg-1。48 h后血糖≥11.1 mmol·L-1且持续2周维持在此高血糖水平[10]。

　　1.2 手术切除胰腺的大部分或全部诱发糖尿病

　　Mehring及Minkowski在1890年发现切除狗胰腺后可使动物产生糖尿现象[1]。此后，国内外学者对此法作了改良，成功制作了较为稳定的糖尿病动物模型。一般选用较大的实验动物,如狗、兔、犬等,其次用大鼠。在行胰腺大部切除(一般80%～90%)后，残存的胰岛受到高糖饮食刺激后使胰岛β细胞功能衰竭形成永久性糖尿病;或结扎动物胰管加高糖饮食使胰岛形成明显的退变而形成糖尿病。手术方法主要用于IDDM造模。

　　1.3 注射激素诱发糖尿病

　　给动物注射糖皮质激素、生长激素、甲状腺素、胰高血糖素等拮抗胰岛素的作用，可制备内分泌性糖尿病动物模型[11]。糖皮质激素和胰高血糖素促进糖原异生，抑制外周组织葡萄糖的利用即降低胰岛素的效能;生长激素使外周组织利用葡萄糖发生障碍，对胰岛素敏感性降低，刺激β细胞过度分泌，终致衰竭产生糖尿病。

　　1.4 病毒诱导方法

　　柯萨奇病毒多感染儿童，主要经肠道传播，引发胰腺炎，导致淋巴细胞浸润，β细胞坏死，可使新生的小白鼠、田鼠等致病，对成年鼠不致病[12]。选用DBA/2雌性小鼠，皮下接种脑炎、心肌炎病毒M型变异株，4～7 d后出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺中胰岛素含量降低。其高血糖为特发性，伴有明显低胰岛素血症。在某些小鼠中可自然缓解，但糖耐量异常及高血糖在恢复期中仍将存在[13]。

　　2 自发性糖尿病模型

　　2.1 自发性糖尿病BB Wistar大鼠模型

　　是筛选出来的一种自发性、遗传性IDDM动物模型。其发病和自身免疫性毁坏胰腺β细胞引发胰腺炎及胰岛素缺乏有关。大鼠大约在60～120日龄时发病,发病突然。数天后，糖尿病动物出现严重的高血糖，低胰岛素和酮血症[14]。免疫抑制剂[15]、将新生鼠胸腺切除[16]等可预防糖尿病的发生，说明自身免疫参与发病。

　　2.2 自发性糖尿病(NagoyaShibataYasuda，NSY)小鼠模型

　　NSY是从JclICR远交系小鼠根据葡萄糖耐量选择繁殖产生的，具有年龄依赖性自发性糖尿病的特征，在第48周雄性小鼠中累积糖尿病的发生率为98%，而雌性小鼠仅为37%。在第24周时可出现显著的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能减弱，具有空腹高胰岛素血症的特点,此模型有助于人类NIDDM遗传学倾向及病理发生的研究，尤其对胰岛素抵抗在发病中的作用适用[17]。

　　2.3 发性非肥胖糖尿病(GotoKakisak wistar rats，GK)大鼠模型

　　此模型雄性和雌性发病率相同，其特征有：葡萄糖刺激的胰岛素分泌受β细胞数目减少，肝糖生成过多，肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗[18]。适于作为人类NIDDM的有关研究。

　　2.4 自发性遗传糖尿病中国地鼠模型

　　原为我国黄河以北一些省份的优势鼠种。美国Meier和Yerganian将黑线仓鼠通过近亲繁殖获得近交系，具有自发性、遗传性糖尿病的特点。发病率可达90%，雌性多于雄性。这种动物模型为非肥胖型，以中轻度高血糖为特征，血清胰岛素表现多样，胰岛病变程度不一，类似于人类的NIDDM。

　　3 转基因糖尿病模型

　　3.1 2型糖尿病模型

　　2型糖尿病是多基因遗传,有许多机制参与发病。运用转基因动物研究胰岛素分泌调节、肝葡萄糖产生、胰岛素分子结构、胰岛素受体敏感性及受体后水平缺陷等在2型糖尿病发生中的作用已有文献报道[20]。

　　3.1.1 GK/IRS1双基因剔除小鼠

　　Bali等[21]将小鼠葡萄糖激酶基因外显子用新霉素抵抗(neomycin resistance)基因取代制成目标载体杂合入正常小鼠，制得GK+/小鼠。发现该鼠糖耐量减退、肝细胞和胰岛β细胞葡萄糖敏感性低下，这种胰岛β细胞和肝细胞葡萄糖激酶活性减退所引起的疾病与人青春晚期糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)相似可作为MODY的动物模型。

　　3.1.2 胰岛素受体/胰岛素受体底物

　　1双基因剔除杂合体小鼠 Bruning等[22]给小鼠双杂合入胰岛素受体(insulin receptor，IR)和胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate，IRS1)的无效等位基因，使该鼠IR/IRS1表达减少。4～6个月后40%小鼠发生显性糖尿病，伴有高胰岛素血症和胰岛β细胞增生，从而制得NIDDM动物模型，存在明显胰岛素抵抗。而且证实IR及其信号转导锁链中的各种缺陷具有协同效应。

　　3.1.3 IRS2-/-小鼠

　　IRS2-/-小鼠表现为胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足(不能引起β细胞代偿性增生，无法对抗胰岛素抵抗)，从而引发NIDDM。但IRS2-/-小鼠单个β细胞胰岛素分泌正常甚至升高。

　　3.2 MODY

　　MODY3[23]是2型糖尿病的1个亚型，有5种蛋白质的基因缺失或突变可以导致MODY，分别是肝细胞核因子4α(HNF4α/MODY1)，葡萄糖激酶(GKP/MODY2)，肝细胞核因子1α(HNF21AP/MODY3)，胰岛素启动因子(IPF1/MODY4)，肝细胞核因子1β (HNF1β/MODY5)。

　　β细胞特异HNF1α(hepatocyte nuclear factor1α，肝细胞核因子21α)突变的转基因动物，可特异抑制β细胞HNF1α的功能，雄性表达突变蛋白者在6周龄时出现糖尿病症状，胰岛素分泌功能受损，雌性糖耐量异常。糖尿病鼠胰岛内胰岛素水平显著下降，高血糖素水平升高。动物出生后胰岛生长方式改变(α细胞/β细胞比值升高),β细胞超微结构显示包括线粒体肿大在内的β细胞严重损伤。

　　3.3 妊娠糖尿病模型

　　妊娠期胰岛素抵抗可引起妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)，患者胎儿典型特征是巨大，而成年后患肥胖和NIDDM的概率上升。杂合体Leptin受体缺乏(Leprdb/+)小鼠发生GDM症状，其子代特征与GDM母亲所生胎儿症状相似[24]。杂合体C57BL/KsJdb/+小鼠[25]也发生GDM，妊娠引起PI3K与IRS1解离，与IR结合活性增加，胰岛素介导的精氨酸磷酸化增多而IRS1表达及其酪氨酸磷酸化减少从而使IRS1结合及激活PI3K能力下降，胰岛素功能不能发挥，出现胰岛素抵抗。

　　3.4 线粒体糖尿病

　　β细胞Tfam(mitochondrial transcription factor A)突变的小鼠，大约5周龄时发生糖尿病，表现为严重的mtDNA耗竭，氧化磷酸化不足和7～9周时胰岛内观察到异常的线粒体。随着转基因技术的发展和对糖尿病发病机制的逐步阐明，必将有更多更好的接近人类糖尿病的转基因动物模型出现，促进对糖尿病的研究和糖尿病防治药物的开发[26]。

　　转基因动物技术总的来说有2种方法:(1)传统的转基因方法，即新基因信息的转入和在动物体内的表达;(2)基因打靶方法，即将特定的内源性基因断裂或以其他基因代替[19]。胰岛素信号转导包括胰岛素与受体的结合，受体自身磷酸化，受体底物磷酸化等，磷酸化的受体底物与磷脂酰肌醇(3)激酶 (phosphotidy linositol3kinase，PI3K)或其他信号转导蛋白结合将其激活启动下游级联反应,引起糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase3，GSK3)活性降低，糖原合成减少;葡萄糖转运载体(glucose transporter，GLUT4)从胞内移至质膜，摄取葡萄糖入细胞。自身磷酸化的受体配基复合物也可进入核内体，在其中聚集磷酸化其中的底物。据此，将胰岛素信号转导通路中的某个基因敲除，有望得到理想的糖尿病动物模型。此外，用Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合，可以得到组织或细胞特异性靶基因被敲除的动物模型。

　　建立理想的糖尿病模型不但对于深入研究糖尿病的病因、发病机制、治疗及预防至关重要,并成为基础研究的有力工具。转基因技术的不断发展必然会有更多更好的接近人类糖尿病的转基因动物模型出现,并促进对糖尿病的研究和糖尿病防治药物的开发。

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