细胞毒T淋巴细胞相关抗原4基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究

　　【摘要】 　　目的: 探讨CTLA4基因多态性位点1722T/C和CT60G/A与中国北方汉族妇女乳腺癌易感性的关系。方法: 采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性方法, 对328例中国北方汉族乳腺癌患者和327例正常对照者进行CTLA4基因1722位点和CT60位点多态性检测。 结果: 乳腺癌患者CTLA4基因CT60位点G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组(28.7% 比23.5%; P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02～1.67); 1722CCT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有明显差异(P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97～0.61), 而在1722位点基因型频率、 等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论: CTLA4基因多态性1722和CT60两个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性。

　　【关键词】 乳腺癌 CTLA 4基因 单核苷酸多态性 单体型

　　Association of cytotoxic T lymphocyte antigen4 gene polymorphisms with susceptibility to breast cancer

　　LI Heng, FU Zhenkun△, WANG Lihong, LI Dalin, WU Na, ZHANG Jie, LI Dianjun*

　　Department of Immunology, Tumour Hospital, Department of Hygienic Microbiology, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

　　[Abstract] AIM: To investigate the association between the CTLA4 promoter1722(T/C) and 3′ untranslated region CT60(G/A) polymorphisms and the risk of breast cancer in Han women of northeast China. METHODS: 328 patients with breast cancer and 327 healthy people as control were genotyped for 1722 and CT60 polymorphism using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. RESULTS: The frequency of the G allele at the CT60 site in breast cancer patients was statistically higher than that in control(28.7% vs 23.5%, P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02-1.67). The frequency of 1722CCT60A haplotype in control was significantly higher than that in breast cancer patients(P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97-0.61). However, the distribution of genotypes at 1722 site was not significantly different between breast cancer patients and control. CONCLUSION: The polymorphism of 1722T/C and CT60G/A may be related to the development of breast cancer in Han women of northern China.

　　[Keywords]breast cancer; CTLA4 gene; single nucleotide polymorphism; haplotype

　　乳腺癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤, 其发病机制虽然尚未完全清楚, 但是免疫系统在其中的作用已逐渐引起了人们的关注。有研究表明, 乳腺癌患者体内存在免疫系统的抑制性环境, 特别是在年轻患者和病情严重患者更为明显, 其中T细胞表面的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)分子发挥了重要作用[1]。人类CTLA4基因定位于2号染色体长臂33带(2q33), 主要表达在活化的T细胞上, 它可与抗原提呈细胞表面的B7分子结合并抑制T细胞的增殖与活化[2]。有研究表明位于CTLA4基因3′端非编码区和基因启动子区的基因变异影响了CTLA4的表达和转录, 其中单核苷酸多态性位点CT60显示出了较强的关联性, 但并不能排除其他位点的作用[3]。为了进一步验证上述基因遗传多态性是否与我国北方汉族妇女乳腺癌的发生相关, 我们选择了转录本末端CT60G/A位点和基因启动子区的1722T/C位点进行了此次病例的对照研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 对象及材料 乳腺癌病例为在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院进行手术治疗的患者, 共340例, 均经组织病理学确诊, 术前均未行放射或化学治疗, 年龄30～73岁, 经患者本人及家属同意的情况下, 取空腹外周静脉血。正常对照组人群外周血由哈尔滨医科大学附属第一医院提供的体检女性获得, 共350例, 平均年龄为(46.3±17.0)岁, 要求没有癌症家族史, 其他详细记录与乳腺癌患者相同。DNA提取试剂盒购自天为时代公司; 温度梯度DNA扩增仪购自Biometra公司; Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司; 引物由上海生物工程公司测序。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA提取 抽取肿瘤患者及正常对照个体的外周血5 mL, 以ACD抗凝,使用DNA提取试剂盒从外周静脉血标本抽提基因组DNA, -20℃保存。

　　1.2.2 CTLA4的1722、 CT60基因片段扩增 采用PCR方法, 用温度梯度DNA扩增仪从基因组DNA中扩增CTLA4基因中含有相应位点的基因片段。PCR反应体系为25 μL, 其中基因组DNA 0.3 μg, 1×PCR缓冲液, 0.3 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, 2 U Taq DNA聚合酶, 上、 下游引物各0.1 μmol/L。PCR反应条件为: (1)启动子区1722T/C位点PCR引物序列: 上游为5′CTAAGAGCATCCGCTTGCACCT3′; 下游为5′TTGGTGTGATGCACAGAAGCCTTT3′。PCR扩增条件: 94℃预变性5 min; 94℃ 15 s, 58℃ 5 s, 72℃ 45 s进行30个循环; 最后72℃延伸7min。 PCR扩增片段为486bp。(2)转录本末端CT60G/A位点PCR引物序列: 上游为5′GAGGTGAAGAACCTGTGTGTTAAA3′; 下游为5′ATAATGCTTCATGAGTCAGCTT3′。PCR扩增条件: 94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 55.6℃ 30 s, 72℃ 30 s进行30个循环; 最后72℃延伸5 min。PCR扩增片段为178 bp。

　　1.2.3 限制性片段长度多态性分析 PCR扩增产物分别加入限制性内切酶BbvⅠ和HpyCH Ⅳ, 于37℃水浴16h, 20g/L琼脂糖凝胶电泳分离, 然后用溴化乙啶染色观察。

　　1.2.4 统计学处理 采用Arlequin软件进行HardyWeinberg平衡规律计算基因型和等位基因频率, 运用统计学软件SPSS和haploview协助对单体型数据进行处理, 采用χ2检验和Logistic回归分析计算比数比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence interval, CI), 以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 CTLA4基因1722、 CT60位点多态性酶切结果 1722位点PCR扩增片段为486bp, 1722位点经限制性内切酶Bbv Ⅰ消化和20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 基因型T/T纯合子酶切片段为486 bp 1条带, 基因型C/C纯合子酶切片段为270 bp和216 bp2条带, 基因型T/C杂合子酶切片段为486bp、 270 bp和216bp3条带(图1)。CT60位点经限制性内切酶HpyCH Ⅳ消化和20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 基因型G/G纯合子酶切片段为178 bp1条带, 基因型A/A纯合子酶切片段为107 bp和71bp2条带, 基因型A/G杂合子酶切片段为178bp、 107bp和71 bp3条带(图2)。

　　2.2 乳腺癌患者和正常对照组CTLA4基因1722、 CT60基因多态性分布 经Arlequin软件检验, 乳腺患者组和正常对照组CTLA4基因1722、 CT60基因型分布符合HardyWeinberg平衡。CT60位点乳腺癌患者组A/A、 A/G、 G/G基因型频率与正常对照组比较(表1), 差异无统计学意义(P>0.05), 但是G等位基因频率在乳腺癌患者组中明显高于正常对照组(28.7%比23.5%; P=0.0352, OR=1.30, 95% CI=1.02～1.67)。然而, 在1722位点上, 乳腺癌患者组T/T、 T/C、 C/C基因型频率以及T、 C等位基因频率与正常对照组比较差别均无统计学意义。

　　图1 CTLA4 基因含1722T/C位点的PCR产物经BbvⅠ酶切后的电泳图(略)

　　Fig 1 Electrophoresis chart of PCR products containing 1722T/C SNP of CTLA4 digested by Bbv Ⅰ

　　M: DNA marker; 1: TT; 2, 4: CC; 3: TC.

　　图2 CTLA4基因含CT60G/A位点的PCR产物经HpyCH Ⅳ酶切后的电泳图(略)

　　Fig 2 Electrophoresis chart of PCR products containing CT60G/A SNP of CTLA4 digested by HpyCH Ⅳ

　　M: DNA marker; 1, 3, 5: AA; 2, 4: AG; 6: GG.

　　表1 乳腺癌患者和正常对照1722T/C、 CT60G/A位点基因型及等位基因分布(略)

　　Tab 1 Distributions of genotypes and alleles in 1722 T/C and CT60G/A of patients and controls

　　2.3 乳腺癌患者和正常对照组CTLA4单体型分析 CTLA4单体型与乳腺癌相关性的分析应用haploview软件, 1722和CT602个位点构成了3个主要的单体型(频率>5%)。其中1722CCT60A单体型在对照组中的频率大于病例组中的频率, 有统计学意义(P=0.0283, OR=0.77, 95% CI=0.97～0.61); 而1722TCT60A和1722TCT60G2个单体型在病例组和对照组中的频率无统计学意义(表2)。

　　表2 乳腺癌患者和正常对照1722T/C、 CT60G/A位点单体型分析(略)

　　Tab 2 Analysis of haplotype frequencies between alleles of 1722 T/C and CT60G/A

　　3 讨论

　　乳腺癌的发生和发展过程中细胞介导的免疫反应发挥了重要作用, 然而T细胞的活化是一个复杂的过程, 受TCR和共刺激信号的精细调节。作为CD28的同源分子CTLA4也是T细胞表面重要的共刺激分子, 并且在T细胞应答的不同阶段都发挥了重要的作用, 包括调节T细胞活化的阈值, 抑制T细胞增殖, 和诱导活化T细胞的凋亡[4, 5]。阻断CTLA4可以导致免疫应答的增强, 肿瘤排斥, 在动物实验中与肿瘤疫苗联合应用甚至可以治愈荷瘤的小鼠[6]。鉴于CTLA4分子的重要作用, 它已经被视为体内抑制抗肿瘤免疫的重要调节因子[7]。

　　我们的实验结果表明CTLA4基因CT60位点G等位基因与我国北方汉族妇女乳腺癌有较弱的相关性, 与本实验室前期的研究结果相似[8]。Ueda等[3]的研究显示CT60位点G等位基因与可溶型CTLA4表达的减少有关, 并且与Graves′病、 I型糖尿病和甲状腺功能减退等多种自身免疫性疾病相关。Cozar等[9]的研究显示在西班牙人群中CT60位点的AA基因型在肾细胞癌患者中有较高频率, 提示CTLA4可能是肾细胞癌的一个易感基因, 但在结肠癌中并没有明显的相关性。我们设想与自身免疫病相关的等位基因在乳腺癌患者中的频率较小, 但是我们的实验结果却与此不符, 这可能是由于人种和地域差异引起的, CT60位点在我国北方人群中对CTLA4基因的影响发生了改变,但其具体机制还需要进一步研究。而且由于人群的差异在上述报道中G等位基因在人群中占优势, 而在我们的研究对象中A等位基因则更加普遍。尽管CTLA4启动子区域基因多态性的意义尚不明确, 但已有研究证实, 位于CTLA4基因启动子区的基因型与CTLA4的表达有关, 318T等位基因可能参与了CTLA4表达的上调[10, 11], 表明启动子区域等位基因的变化能够改变转录调节区的功能, 从而影响CTLA4分子的表达水平, 引起个体对疾病易感性的差异。还有研究显示1722位点C等位基因在白人群体中与乙型肝炎的清除有关, 这一作用有可能与它减少了CTLA4的产生有关[12]。在我们的研究中虽然单独分析1722位点与乳腺癌没有明显的相关性, 但是单体型1722CCT60A在对照组中的频率明显大于在病例组中的频率, 提示该单体型或者与其关联的多态性位点可能降低了CTLA4的转录或者表达水平, 从而减少了乳腺癌的发病风险。

　　总之, 本研究表明CTLA4基因多态性1722和CT602个位点与我国北方汉族妇女乳腺癌发病存在一定的相关性, 但是由于我们仅是在基因水平上进行了研究, 这些多态性位点的具体作用机制还需要在蛋白质和细胞水平上对CTLA4分子的表达和功能进行研究后才能进一步阐明。

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