hTRsiRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究

　　【摘要】 　　目的: 构建RNA干扰(RNAi)腺病毒, 通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、 降低瘤细胞中的端粒酶活性、 以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法: 首先用一种新的体外连接法构建腺病毒AdhTRsiRNA, 表达靶向hTR的小干扰RNA分子(siRNA), 用100 MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系, 再用TRAPELISA法测定细胞端粒酶活性、 Realtime PCR测定hTR的mRNA水平、 流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶(hTERT)的蛋白变化。结果: 感染了AdhTRsiRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低, 其中以HeLa细胞降低最明显, 其端粒酶活性抑制率达到58.87%, hTR的mRNA表达下调70.21%, 细胞凋亡率为29.7%, 但hTERT的蛋白表达并不被阻断。结论: AdhTRsiRNA可以有效、 特异地抑制hTR基因表达, 诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡, 具有抗肿瘤活性; 此结果提示AdhTRsiRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值。

　　【关键词】 hTR 腺病毒 RNA干扰 端粒酶 抗肿瘤作用

　　Construction of adenovirus expressing siRNA against hTR and its antitumor activity in vitro

　　LI Yan, XIAO Liying, YAO Gang, LI Hong, YANG Zhiwei, LI Wanyi, JIANG Zhonghua, LI Mingyuan*

　　State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Department of Microbiology, West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041; Chengdu Institute of Biological Products, Chengdu 610063, China

　　[Abstract] AIM: To study the effect of the hTRsiRNA adenovirus on hTR mRNA gene silence, telomerase activity inhibition and antitumor in vitro. METHODS: RNAi adenovirus vector, AdhTRsiRNA, and negative control AdNTsiRNA were constructed by an improved ligation method. Different tumor cells and liver cell line, HL7702, were infected with 100 MOI of the recombinant adenoviruses. TRAPELISA, Realtime PCR and FCM were used to analyze telomerase activity, hTR mRNA, apoptosis rate and hTERT protein expression. RESULTS: As compared with AdNTsiRNA, AdhTRsiRNA reduced both hTR mRNA levels (70.21%) and telomerase activity (58.87%) of HeLa cells significantly, increased apoptosis rate (29.7%). But the telomerase activity of HL7702 and hTERT protein didn't show the tendency of decrease. CONCLUSION: It is supposed that the hTRsiRNA adenovirus could knockdown hTR gene specifically and suppress the tumor cell growth in vitro efficiently. Maybe this siRNA expressing recombinant adenovirus system could be a new method for cancer gene therapy.

　　[Keywords]hTR; adenovirus; RNA interference; telomerase; antitumor

　　2006年的诺贝尔医学奖授给了发现RNA干扰(RNAinduced interference, RNAi)现象的科学家[1], 使目前广泛用于肿瘤和病毒所致疾病研究[2, 3]的RNAi技术更是锦上添花。为达到稳定、 高效的干扰效果, 目前科研人员都比较推崇用病毒载体介导的细胞内小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)表达技术[3]。端粒酶是维持肿瘤细胞永生化的重要分子基础, 通过抑制端粒酶活性来达到治疗恶性肿瘤的目的已成为肿瘤基因治疗的热点。人端粒酶有2个重要组成部分, 人端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)和人端粒酶反转录酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)。hTR提供合成端粒DNA的模板, 其中5′CUAACCCUAAC3′部分的作用更为关键[4]。本课题运用一种新的腺病毒载体构建方法, 构建能表达针对hTR的模板部分基因的 siRNA 的腺病毒, 并通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞端粒酶活性和抗肿瘤的能力。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BDTM Knockout Adenoviral RNAi System 1购自BD公司, 该试剂盒提供BamHⅠ/EcoRⅠ线性化的pSIRENShuttle, ICeuⅠ/PISceⅠ线性化的pAdenoX, siRNA阴性对照退火寡核苷酸等; 限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Gene公司; Lipofectin2000为Invitrogen产品; RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas;QUANT SYBR Green PCR reagents购自TIANGEN; TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒购自Roche; 兔抗hTERT抗体来源于SantaCruz, FITC标记的羊抗兔二抗由北京中山公司提供; 各细胞系购自四川大学华西移植免疫实验室。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RNAi腺病毒的构建 利用BD公司siRNA靶序列分析设计系统, 选择针对hTR( GenBank number U86046)的 19nt 的序列, 136～154位碱基作为特异性siRNA靶序列, 并设计鉴定用的酶切位点PstⅠ。完整的67 nt正义链为5′GATCCGTTGTCTAACCCTAACTGAGTTCAAGAGACTCAGTTAGGGTTAGACAACTTTTTTCTGCAGG3′, 反义链为5′AATTCCTGCAGAAAAAAGTTGTCTAACCCTAACTGAGTCTCTTGAACTCAGTTAGGGTTAGACAACG3′(下划线部分是靶序列)。上述2条链由生物公司合成, 退火后亚克隆进BamHⅠ/EcoRⅠ线性化的pSIRENShuttle质粒, 重组质粒(pSIRENhTR)经Kan筛选、 质粒DNA用酶切和测序鉴定。

　　用ICeuⅠ/PISceⅠ双酶从pSIRENhTR中切出含U6RNA启动子和67 bp的插入片段, 纯化的酶切片段再与ICeuⅠ/PISce Ⅰ线性化的pAdenoX(32700 bp)连接[5], 并用SwaⅠ酶切去除非重组的pAdenoX; 将连接产物转化DH5α、 经Amp筛选而得到腺病毒的骨架质粒pAdhTR。用试剂盒提供的PCR引物快速鉴定pAdhTR, 能扩增出287 bp的克隆为阳性克隆; 用小量低拷贝质粒的提取方法提取pAdhTR, 经 XhoⅠ 单酶切和ICeuⅠ/PISceⅠ双酶切鉴定; 最后用U6上游引物测序以确证克隆的正确性。

　　将鉴定正确的pAdhTR用PacⅠ酶切线性化, 取4 μg纯化的酶切产物包裹入10 μL的脂质体中, 加入密度为90%左右的HEK293细胞中进行腺病毒的包装。当HEK293出现细胞病变效应后直接用吸管轻轻吹打收集细胞, 经3次反复冻融收获病毒, 即为表达针对hTR的siRNA的原代腺病毒(AdhTRsiRNA), 并用PCR快速鉴定重组病毒的正确性。将鉴定正确的重组病毒按试剂盒手册扩增至第4代、 并纯化、 测定滴度。同法将siRNA阴性对照退火寡核苷酸依次克隆到pSIREN和pAdenoX制备对照病毒(AdNTsiRNA)。

　　1.2.2 细胞培养及病毒感染肿瘤细胞 将HeLa(人宫颈癌细胞系)、 HepG2 (人肝癌细胞系)、 A549(人肺癌细胞系)、 KB(人口腔鳞癌细胞系)和HL7702 (正常人肝细胞系)加入完全培养基, 置于37℃、 50 mL/LCO2 孵箱中培养。在上述细胞中分别加入100 MOI(multiplicity of infection)的AdhTRsiRNA 和AdNTsiRNA。在病毒吸附细胞4 h后加入2 mL新鲜的生长培养基继续培养, 于不同时间点收集细胞作不同指标的检测。实验设不加病毒的细胞对照组。

　　1.2.3 TRAPELISA法测定细胞端粒酶活性 病毒感染后第3天, 分别收集各组细胞, 用TRAPELISA(telomeric repeat amplification protocolenzyme linked immunosorbent assay)测定细胞端粒酶活性, 具体步骤是: 加200 μL冷的裂解缓冲液重悬细胞, 冰浴30 min。4℃、 16000 g离心20 min, 吸取细胞裂解上清液备用。取上述2 μL裂解上清液置于PCR管中, 并加入2×TRAP反应混合液(包含端粒酶底物、 生物素标记的P1TS引物和P2引物、 核苷酸和Taq多聚酶) 25 μL、 DEPC处理的灭菌水23 μL, 在PCR仪上进行TRAP反应: 25℃ 10 min, 94℃ 5 min, 30个循环(94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 90 s), 最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物, 加20 μL 变性剂, 室温孵育10 min; 再加入225 μL的杂交液(包含地高辛标记的探针)混匀; 转移100 μL加到链亲和素包被的微孔板于37℃ 300 r/min振摇2 h; 弃杂交液, 洗液充分清洗。每孔加100 μL过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(AntiDIGPOD), 室温下300 r/min振摇30 min; 洗板5次, 每孔加100 μL 四甲基联苯胺(TMB), 300 r/min振摇, 室温显色20 min; 加入终止液100 μL。用酶标仪测定A450值(参比值为A690)。实验的阴性质控组为实验细胞液经65℃ 10 min水浴灭活端粒酶; 阳性质控组为试剂盒提供的人胚肾293细胞提取物。阳性、 阴性、 空白对照管操作同实验管。按公式(ANT-AhTR)/ANT×100%计算端粒酶活性抑制率。其中端粒酶活性抑制率最高的HeLa细胞用于后续实验。

　　1.2.4 荧光定量PCR检测hTR mRNA水平 病毒感染后1、 3和6 d收集HeLa细胞, 用TRIzol提取细胞总RNA, 反转录成cDNA, 用荧光定量PCR扩增hTR(片段长179 bp, 引物序列是5′CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3′和5′CGAACGGGCCAGCAGC TGACAT3′)[6]。同时扩增GAPDH对照(片段长142 bp, 引物序列是 5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′和5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′)。扩增参数为: 95℃ 5 min激活热启动酶, 然后 94℃ 20 s, 53℃ 30 s, 72℃ 40 s循环40次, 最后72℃延伸10 min。 hTR相对于GAPDH的mRNA含量采用△△Ct 方法计算[7]。

　　1.2.5 FCM检测细胞凋亡 收集病毒感染后的细胞制备成单细胞悬液, 用预冷的700 mL/L乙醇固定, 然后用碘化丙啶(PI)染色, 调整细胞密度为5×108/L, 上机检测, 并通过软件设门去除坏死细胞, 分析亚G1峰细胞的百分率, 即细胞凋亡率。

　　1.2.6 间接免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平 将病毒感染后3 d和6 d的HeLa细胞收集制备成单细胞悬液, 用间接免疫荧光标记法[8]处理细胞后上FCM检测荧光强度。阴性对照为不加兔抗人hTERT抗体的细胞, 其余操作相同。

　　1.2.7 统计学处理 每个实验重复3次, 实验数据用x±s表示。采用SPSS11.5处理各实验数据, P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 腺病毒的构建和鉴定 挑取氨苄平板中的10个克隆做快速PCR鉴定, 结果有8个克隆扩增出287 bp的条带, 克隆阳性率为80%, 图1显示其中1个阳性克隆的PCR鉴定结果。pAdhTR质粒DNA的酶切结果见图2, pAdhTR的质粒电泳图谱呈现3条带, 位置在19000 bp以后; 用Xho Ⅰ酶切pAdhTR能切出6条带, 而PISceⅠ/ICeuⅠ双酶切的大条带位置与pAdhTR条带位置接近, 但小片段(约360 bp)图中不能清晰显现。PCR和酶切鉴定pAdhTR的结果均与预期相符。最后用测序确证, 测出的序列依次包括U6(pSIREN上的序列)、 RNAi序列(插入的67 nt)和pAdenoX上的序列, 其碱基组成也正确(测序结果未显示)。腺病毒AdhTRsiRNA和对照病毒AdNTsiRNA的PCR快速鉴定结果也同图1, 两病毒扩增至第4代时的滴度分别为1.0×1010 pfu/mL和1.5×1010 pfu/mL。

　　图1 重组pAdhTR的PCR快速鉴定(略)

　　Fig 1 Rapid PCR analysis of recombinant pAdhTR

　　M: DL 2000 marker; 1: PCR in the presence of template; 2: PCR in the absence of template.

　　图2 重组pAdhTR的酶切鉴定(略)

　　Fig 2 Restriction enzyme mapping of recombinant pAdhTR

　　1: pAdhTR shamdigested in the absence of enzymes; 2: pAdhTR digested with XhoⅠ; 3: pAdhTR digested with PISceⅠ/ICeuⅠ; M: λEcoRⅣ marker.

　　2.2 肿瘤细胞端粒酶活性降低 各组细胞的端粒酶活性测定结果见表1, DMEM组和AdNTsiRNA组的各种肿瘤细胞系均具有较高的端粒酶活性, 两组间没有差异; AdhTR siRNA 组的各种肿瘤细胞的端粒酶活性均有所降低, 其中以HeLa细胞的酶活性降低最明显, 故在后续的实验中选择该肿瘤细胞系; 但HL7702细胞的端粒酶活性基本不受影响。

　　表1 TRAPELISA结果(A450)和端粒酶活性抑制率 (略)

　　Tab 1 Results of TRAPELISA (A450) and inhibition rate of telomerase activity

　　aP<0.05 vs AdNTsiRNA group.

　　2.3 AdhTRsiRNA抑制hTR的mRNA表达 HeLa细胞在感染AdhTRsiRNA后, 细胞中hTR的mRNA水平随时间的延长而逐渐降低, 在第6天时hTR的mRNA表达量最低, 此时hTR mRNA的相对量减少了70.21%[(相对量NT-相对量hTR)/相对量NT×100%]。荧光定量PCR实验结果见图3。

　　图3 AdhTRsiRNA抑制hTR mRNA表达(略)

　　Fig 3 AdhTRsiRNA mediated the suppression of hTR mRNA expression

　　2.4 AdhTRsiRNA诱导HeLa细胞凋亡 感染了腺病毒的HeLa细胞出现了亚G1峰, 提示其中有细胞经历了凋亡过程。在实验的第3天, 对照病毒AdNTsiRNA和实验病毒AdhTRsiRNA感染的HeLa细胞凋亡率分别为3.8%和3.3%, 二者的差别没有统计学意义。但是到了实验的第6天, AdhTRsiRNA感染组细胞凋亡率高达29.7%, 而对照病毒组只有10.6%, 二者的差别有统计学意义(图4)。

　　图4 AdhTRsiRNA诱导HeLa细胞凋亡(略)

　　Fig 4 Apoptosis in HeLa cells induced by AdhTRsiRNA

　　a: AdNTsiRNA treated at 3 day; b: AdhTRsiRNA treated at 3 day; c: AdNTsiRNA treated at 6 day; d: AdhTRsiRNA treated at 6 day.

　　2.5 AdhTRsiRNA对hTERT蛋白表达的影响 通过FCM测定平均荧光强度值, 以此反映hTERT蛋白的表达情况, 其值越高则表明hTERT蛋白表达越多。本次实验阴性对照的平均荧光强度值为0.4, 而AdNTsiRNA感染HeLa细胞3 d和6 d的平均荧光强度值分别为1.9和1.6; AdhTRsiRNA感染HeLa细胞3 d和6 d的荧光强度为1.7和1.7, 不同处理组以及不同时间组反映hTERT蛋白表达的平均荧光强度值的差异均无统计学意义。

　　3 讨论

　　腺病毒载体由于其宿主范围广、 对人致病性低、 在增殖和非增殖细胞中均能高效感染等优点, 广泛受到学者的青睐。以前构建腺病毒载体的方法主要有2种[9]: 一是在哺乳动物细胞中进行腺病毒的同源重组, 二是目前多数实验室采用的pAdEasy系统在大肠杆菌BJ5183中同源重组的方法。但这2种方法存在重组率低、 鉴定困难、 需要费时的噬斑纯化等不足。在本研究中, 我们采用了新的体外连接法构建重组腺病毒。该方法制备腺病毒时无需在细胞或细菌中进行同源重组, 而且SwaⅠ酶切可以去除非重组的pAdenoX, 因此几乎所有的转化克隆均含有重组腺病毒DNA, 当然就无需再进行噬斑纯化, 并且该方法重组腺病毒效率高于上述2法[5]。

　　要想获得理想的RNAi效果, 靶位点的选择是很重要的。就端粒酶而言, 我们认为端粒酶的模板作用至关重要, 所以选择了靶向hTR模板区的siRNA。我们所构建的hTRsiRNA腺病毒能感染多种细胞, 它能使HeLa的端粒酶活性下降58.87%, hTR表达的mRNA下降70.21%, 但却不影响hTERT的蛋白表达, 而且对正常肝细胞HL7702也没有明显的影响, 说明hTRsiRNA腺病毒沉默hTR基因的方式是高效的, 并具有序列特异性和肿瘤细胞特异性。上述研究结果也提示端粒酶活性降低的机制可能是因为重组腺病毒表达的siRNA剪切了hTR模板区的mRNA, 导致hTR mRNA迅速减少, 继而使端粒酶的活性降低。

　　一般的端粒酶抑制剂常常需要一个月左右才能将端粒缩短到一个阈值, 细胞才出现明显的凋亡; 我们用FCM检测hTRsiRNA腺病毒处理后的HeLa细胞, 在6 d就出现了29.7%的细胞凋亡。这可能因为AdhTRsiRNA干扰了hTR基因并抑制了端粒酶活性以后, 同时导致了端粒的缩短或端粒酶复合体的改变, 而后者的改变能引起端粒末端的脱帽, 从而直接损伤DNA和诱导细胞快速凋亡[10]。AdhTRsiRNA也有可能直接或间接刺激了不依赖端粒缩短的其他的凋亡途径, 比如caspase途径或p53途径, 值得进一步探索。 总之, 我们构建的hTRsiRNA腺病毒可有效沉默hTR基因、 抑制端粒酶活性, 显示其体外抗肿瘤活性。下一步我们还将建立裸鼠荷瘤模型, 继续深入研究该重组腺病毒的体内抗肿瘤能力, 有望为肿瘤的基因治疗提供一条新的途径。

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