HLA-DRB1及DQB1等位基因多态性与　宁夏回族人群食管癌的关联性研究

　作者：马斌1，郭鑫1，高平2 作者单位：1.宁夏银川市第一人民医院，宁夏 银川 7500012.宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004

　　【摘要】 目的探讨宁夏回族人群食管癌与HLA-DRB1及DQB1等位基因多态性的关联性。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物( PCR-SSP)技术，检测肿瘤组40例、对照组143例的 HLA-DRB1等位基因17 个，HLA-DQB1等位基因19个。结果(1)肿瘤组 HLA-DR14.1 DQB1*0301基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P=0.00);(2)对照组HLA-DR3、DQB1*0501基因频率明显高于肿瘤组，差异有统计学意义(P<0.01);(3)对肿瘤患者 HLA-DRB1、DQB1 等位基因进行遗传平衡分析，差异无统计学意义，说明各等位基因为随机组合，无特殊意义;(4)对部分模糊的条带及阳性实验结果进行基因测序比对分析验证，基本完全符合。结论(1) HLA-DR14.1，HLA-DQB1*0301两种等位基因增加宁夏回族人群食管癌发生的易感性;(2)HLA-DR3，HLA-DQB1*0501是宁夏回族人群食管癌发生相关联的抗性等位基因。

　　【关键词】 人类白细胞抗原;回族;食管癌;基因多态性

　　[Abstract]ObjectiveTo analyze the association of polymorphisms of HLA-DRB1 and DQB1 in genetic susceptibility to Esophageal cancer in Ningxia Hui ethnic. MethodsPolymerase chain reaction sequence specific primer (PCR-SSP) technique was used to test 17 DRB1 phenotypes and 19 DQB1 phenotypes of HLA-II gene including 40 patients and 143 healthy people.ResultsThe frequency of HLA-DR14.1 and DQB1*0301 in the subject group was higher than that in the control group (P=0.00)，The frequency of HLA-DR3 and HLA-DQB1*0501 in the control group was higher than that in the subject group (P<0.01); Heredity equilibrium analysis was used to test HLA-DRB1 and DQB1 phenotypes from the subject group，it illustrates that the alleles is constituted casually，not any special significance;ConclusionHLA-DR14.1 and HLA-DQB1*0301 are the susceptive gene of esophageal cancer patients of Hui ethnic in Ningxia. HLA-DR3 and HLA-DQB1*0501 are protective gene of esophageal cancer patients of Hui ethnic in Ningxia.

　　[Key words]HLA; Esophageal Cancer; Hui ethnic; Polymorphisms

　　我国部分少数民族食管癌死亡情况的比较统计结果表明，回族食管癌的死亡率居第2位[1],成为严重威胁人类生命健康的一种恶性疾病。本研究运用PCR-SSP技术分析HLA-DRB1和DQB1等位基因多态性与宁夏回族食管癌的关联性，探讨宁夏回族人群食管癌发病的遗传易感性。

　　1资料与方法

　　1.1样本来源：

　　食管癌患者40例(男33例，女7例)，平均年龄(62±8.5)岁。均经病理确认，未经放化疗治疗，主要病理类型为鳞癌39例，占97%;腺癌1例，占3%。对照组为宁夏回族健康个体，共143例(男91例，女52例)，平均年龄(49±10.5)岁。病例组及对照者均3代内无与其他民族有通婚史，无明确亲缘关系且长期居住本地。

　　1.2实验方法

　　1.2.1DNA 提取：

　　采用北京赛百盛生物有限公司提供的硅胶模型基因组DNA提取盒提取DNA，核酸样品浓度通过紫外分光光度计检测法进行分析。

　　1.2.2HLA测定:

　　采用 PCR-SSP 法，序列特异引物根据1995年公布的HLA-Ⅱ类等位基因核苷酸序列[2]，参照Olerup[3-4]等的引物序列设计，由上海生工生物技术有限公司合成;内对照引物C5:5′TGCCAAGTGGAGCACCCAA3′和C3：5′GCATCTTGCTCTGTGCAGAT3′。扩增产物长796bp，每个样品DRB位点、DQB1位点同时进行23个、20个独立的PCR反应,能鉴定17种DRB1基因的DR1-DR18特异性以及19种DQB1等位基因，并包含3种作为附加对照的超型特异性DR51、DR52、DR53。

　　1.2.3PCR扩增反应：

　　反应体系，总体积15μl样本DNA(50ng/μl)1μl，2×Taq PCR Master Mix 7.5μl，上下游引物各(10pmol/ul)1μl，内对照引物各(10pmol/μl)0.2μl，灭菌去离子水 3.6μl，每一个PCR反应管中均含有确定相应位点等位基因型别的特异性引物和内对照引物。先按引物的数量计算反应体系的总体积，加于0. 5ml的D-Mix 管中，混匀，分装于0. 2m1的薄壁PCR管中，分别加入各特异引物，短暂离心后按设置的条件进行扩增：预变性94℃4min变性94℃30s，退火64℃1min延伸72℃1min，72℃30s(DQB1)后延伸72℃1min热循环数30。

　　1.2.4PCR扩增产物检查：

　　PCR反应结束后，取扩增产物12μl直接上样，以100 bp DNA Ladder和D2000 分子片段大小标准物做参照，用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，电压10V/cm，时间20min，电泳结束后于紫外灯下观察并记录结果。每个基因座位检出2个等位基因，如果检出1个按纯合子计算。

　　1.3质量控制

　　1.3.1假阴性质控：

　　每个反应的结果中均应有阳性内参照阳性产物,若无此产物即为假阴性。

　　1.3.2假阳性质控：

　　根据所扩增片段的碱基数来判断是哪一对的产物,每次均设阳性对照对可疑结果进行重复实验。同时，参照HLA-DRB1与-DRB3、-DRB4、-DRB5相关性等,可加以判断。

　　1.3.3重复性实验：

　　对一些条带模糊或结果可疑者，可重复实验3次;随机抽取20例标本进行重复实验，必须都获得相同的结果。

　　1.4PCR产物序列分析：

　　随机对1条带模糊或已知阳性结果的样本进行PCR产物的回收与纯化，纯化后的产物进行测序。标本送至北京天根生物技术有限公司测序，测序方法为Sanger法。

　　1.5统计学方法：

　　HLA-DRB1、DQB1位点各等位基因及基因型在正常人群、食管癌人群的分布差异通过2×2列联表作卡方检验，对肿瘤患者 HLA-DRB1、-DQB1 基因座位等位基因进行遗传平衡分析。以上数据均通过SPSS13.0统计软件完成。

　　2结果

　　2.1DNA提取后定量：

　　于1%琼脂糖凝胶电泳，样品基因组DNA浓度60-200ng，经稀释后符合浓度要求(50-100ng/μl);验证的DNA纯度A260/A280值波动于1.85-2.0,浓度波动于60-95ng/μl，说明提取样本DNA的纯度和浓度均达到后续实验的技术要求。

　　2.2PCR-SSP 技术检测：

　　在试验过程中设立阴性对照，同时在电泳分析结果时加入分子量标记，PCR反应的结果判断必须在有阳性对照引物扩增条带出现的前提下进行，个体的DRB1或DQB1型别直接由其相应的特异性引物扩增条带的出现确定，实验结果准确可靠，所有对照均呈预定的结果(图1，目录后)。表1肿瘤组与对照组HLA-DRB1基因型分布

　　2.3肿瘤组与对照组HLA-DRB1基因型分布：

　　见表1。由表1可见，肿瘤组 HLA-DR14.1基因频率 (15.00%)，明显高于对照组(2.40%)，RR=7.03，χ2=17.55 (P<0.01)，RR=7.03，RR95%CI可信区间为：18.54-2.67,达到统计学显著水平;对照组HLA-DR3基因频率(13.60%)明显高于肿瘤组(2.50%)，χ2=7.79,P=0.005(<0.01)，RR=0.16，RR 95%可信区间为0.69-0.04，达到统计学显著水平。肿瘤组HLA-DQB1*0301基因频率(30%)明显高于对照组(3.79%)，χ2=54.95，P= 0.00(<0.01)，RR=13.19，RR95%可信区间为29.90-5.82，达到统计学显著水平;对照组HLA-DQB1*0501基因频率(24.24%)明显高于肿瘤组(1.25%)，χ2=8.51,P=0.004(<0.01)，RR=0.09，RR 95%可信区间为0.68-0.01，达到统计学显著水平。对肿瘤患者 HLA-DRB1、-DQB1 基因座位等位基因进行遗传平衡分析，应用拟和优度χ2检验对患者组进Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，患者组观察值与期望值吻合度良好，P>0.05,达到遗传平衡，具有群体代表性。

　　2.4PCR产物序列：

　　随机对一PCR-SSP方法定为HLA-DRB1 * 0901的PCR产物进行序列分析，结果见图2(目录后)。测序结果显示，PCR-SSP法扩增的为HLA-DRB1*0901患者33号样本。

　　3讨论

　　有研究表明HLA- II类分子是T细胞介导的免疫应答中起关键作用的免疫调控分子，其表达缺失或表达过多都将导致免疫反应异常，肿瘤逃逸机体的免疫杀伤，这成为肿瘤发生、发展的可能机制，而且HLA-Ⅱ类抗原的表达与肿瘤浸润淋巴细胞的质量明显相关，表现为淋巴细胞数量的增加即淋巴结转移[4]。

　　本实验结果表明：(1)肿瘤组 HLA-DR14.1 基因频率(15%)明显高于对照组(2.40%)，肿瘤组HLA-DQB1*0301基因频率(30%)明显高于对照组(3.79%)，两者比较有统计学意义。RR(relative risk，相对危险度)>4 时，则认为此病与某种 HLA 抗原肯定有关联;RR 值越大，表示带此抗原的人患某种疾病的危险性越大;RR=1 时，两者无相关;RR<1 时，表示带此抗原者对某种病有抵抗性。当RR<1且95%可信区间(Confidence interval，CI)95%CI<1，提示有保护作用;当RR>1且95%CI>1，提示有易感作用。由此我们认为，HLA-DRB1*14.1、HLA-DQB1*0301是宁夏回族食管癌的易感基因，与国内林军[5](HLA -DRB1*0901及-DQB1*0301等位基因均与食管鳞癌正关联,为其易感基因)的结果部分一致。

　　我们还发现对照组HLA-DR3基因频率(13.60%)明显高于肿瘤组(2.50%)，有统计学意义;对照组HLA-DQB1*0501基因频率(24.24%)明显高于肿瘤组(1.25%)，亦有统计学意义。我们认为，HLA-DR3、 HLA-DQB1*0501是回族食管癌患者的抗性基因即保护基因，这与张静[6](HLA-DRB1*03可能是肿瘤发生相关联的易感基因)的结果正好相反。

　　在遗传学特征方面，宁夏回族健康人群HLA-DRB1中基因频率较高的是DR(13.60%)、DR7(17.80%)、DR12(12.60%)，这与西安交大沈春梅[7]的结果高频等位基因分别为 HLA-DRB1*15 (GF=0.1393)、DRB1*09(GF =0.1311)、DRB1*07(GF =0.1066)相差较大，与赖淑苹[8]的DRB1*07结果相一致。

　　【参考文献】

　　[1]陈湘川.ECRG2基因的遗传多态性与新疆哈萨克族和汉族食管癌的相关性研究[J]. 石河子大学，2006,5:265.

　　[2]Hjelmstrom P，Gisombe R，Lefvert Ak，et al. HLA-DQ association and T-cell receptor V-gene usage in peripheral blood of Swedish myasthenia gravis patients EurJ[J].Immunogenet,1997,24(3):179-89.

　　[3]熊平，杨颖，龚非力,等.1种新HLA-II基因分型法PCR/SSP技术建立[J].免疫学杂志,1996,15(5):331-335.

　　[4]Sadanaga N,Kuwano H， Watanabe M， et al. Local immune response to tumor invasion in esophageal squamous cell carcinoma the expression of human leukocyte antigen-DR and lymphocyte infiltration[ J].Cancer，1994，74(2): 586-591.

　　[5]林军，邓长生，朱尤庆.HLA-DRBl、-DQB1基因多态性与食管鳞癌遗传关联性[J].中华消化杂志,2002,(12) : 726-729.

　　[6]张静.HLA-DRB1、DQB1基因多态性与人体实体肿瘤发生的关联研究[J] .大连医科大学，2006,

　　[7]沈春梅,朱波峰.宁夏回族HLA-A,B,DRB1基因座遗传多态性和单倍型分析[J].第四军医大学报,2008，29(17)：1540-1543.

　　[8]赖淑苹，任惠民.中国西北地区汉、回、维、藏族HLA-DRB基因多态性的研究[J].遗传学报，1999,26(5)：447-457.