前列腺组织特异性启动子介导的TATEGFP的靶向表达

作者：吉恺 作者单位：山东大学医学院生物化学与分子生物学教研室， 济南 250012

　　【摘要】 构建由前列腺特异抗原(PSA)启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列(TAT)的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白pPSATATEGFP表达载体，使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达，提高其特异性及表达效率。方法 以pEGFP1载体为模板，设计包含TAT序列的引物，PCR技术扩增含有酶切位点的小片段Sal ITATEGFPNot I，经胶回收纯化，连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后，提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。 含有PSA启动子的pPSAEGFP载体经Sal I和Not I双酶切后，胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段，得到pPSATATEGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。结果 成功构建pPSATATEGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。结论 引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。

　　【关键词】 前列腺特异抗原;蛋白转导结构域;增强型绿色荧光蛋白;前列腺肿瘤;细胞株

　　specific antigen promoter

　　JI Kai, WANG Xiaoling, XU Aihui, HU Zhimin, YUAN Hui qing

　　(Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　We constructed an expression vector containing EGFP fused to the viral TAT transduction domain and driven by the prostatespecific antigen promoter (pPSATATEGFP) by gene cloning technology. The targeting expression of pPSATATEGFP was examined in prostate cancer cells and colon cells. Methods The vector pEGFP1 served as the framework, and the fragment with the TAT sequence and EGFP was produced by using polymerase chain reaction. After digestion with SalI and NotI enzymes, the fragment was inserted into the T cloning vector. The EGFP expression plasmid driven by the PSA promoter (pPSAEGFP) was digested overnight with SalI and NotI, and a large fragment containing the PSA promoter was purified by gel purification. The TATEGFP, cut with SalI and NotI from the Tvector, was linked with the large fragment with the PSA promoter sequence and generated the pPSATATEGFP construct. The construct was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing, and tested by transfection assay. Result The expression vector pPSATATEGFP was constructed. It was expressed in prostate carcinoma cells, but was not detected in colon cells. Conclusion A slightly higher expression was observed in cells transfected with EGFP fused to TAT compared to the EGFP control plasmid in prostate cancer cells, but no detectable expression was shown in colon cells.

　　Key words: Prostatespecific antigen; Protein transduction domain; Enhanced green fluorescent protein; Prostate neoplasms; Cell lines

　　前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)是人前列腺组织中的特异的由前列腺上皮细胞分泌的单链糖蛋白，该蛋白的表达具有高度组织特异性。利用PSA这一特性可构建前列腺组织特异性表达载体，以期实现肿瘤治疗的靶向性。蛋白转导结构域序列(TAT)是人类艾滋病病毒(HIV)Tat蛋白中的一段碱性氨基酸多肽，含有11～14氨基酸序列，能以不依赖于ATP、膜受体等方式自由穿过细胞膜，并将与之共价连接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)非特异的转导入细胞内部[1]。国内外学者对TAT介导的融合蛋白穿透生物膜的作用进行了大量研究[24]，通过TAT介导药物多肽、蛋白等进出细胞膜可提高转导效率，提高药物疗效。但TAT蛋白转导结构域的穿膜特性缺乏组织特异性，因此本研究试图利用PSA的组织特异性表达，使TAT携带的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能够在前列腺癌细胞中高效、特异表达。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 ① Taq 酶、限制性内切酶、DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司。质粒提取试剂盒购自Invitrogen公司。DNA测序由Invitrogen(上海)公司完成;② 细胞 雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP，大肠癌细胞株HT29由本教研室保存。

　　1.2 质粒构建 以pEGFP1载体为模板[5]，利用2次PCR反应扩增含有TAT序列的EGFP片段。首先扩增EGFP片段，其上游引物(PF1)中含有部分TAT序列，下游引物(PR1)中含Not I酶切位点，通过PCR扩增得到EGFP表达序列。再以此序列为模板，通过TATSal I上游引物(含有起始密码子ATG和酶切位点Sal I及部分TAT序列)，下游引物(PR1)采用第1次PCR所用引物进行扩增，此时得到的EGFP序列其上游含有Sal I酶切位点、ATG和TAT序列，下游含有Not I酶切位点。将PCR产物回收后进行Sal I和Not I的双酶切，纯化后插入T克隆载体，测序鉴定。自T克隆中提取质粒再进行SalI和NotI的双酶切，得到小片段TATEGFP。同时将含有PSA启动子的EGFP表达载体pPSAEGFP进行Sal I和Not I双酶切，回收大片段(含PSA启动子)。通过连接反应，将TATEGFP和PSA启动子片段进行连接，筛选阳性克隆，经酶切及测序鉴定后得到pPSATATEGFP表达载体。

　　扩增引物： PF1: 5′ CAG CGC AGG CGC GGT GGC GGC GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG 3′ ; PR1: 5′CCC GCG GCC GCT TAC TTG TAC AGC TCG TCC A3′ 。 TATSalI上游引物： 5′ CGG GGT CGA CAT GTA CGG CAG GAA GAA GCG TCG TC3′。

　　1.3 细胞培养 前列腺癌细胞、大肠癌细胞分别在含有10%的胎牛血清和新生牛血清的RPMI1640培基中培养，5% CO2、37?℃条件下培养至50%～70%丰度，用于转染实验。

　　1.4 细胞转染 细胞按上述操作培养于24孔培养板中，细胞培养密度至50%～60%时，培养液更换为不含血清的培养液继续培养24?h，脂质体法转染细胞。细胞用Lipofectamine2000(invitrogen)转染试剂分别将pPSATATEGFP、pPSAEGFP(1.0?μg/well)表达载体转入细胞。空白载体pEGFP1为阴性对照，以CMV为启动子的表达载体pEGFPN1作为阳性对照。由于LNCaP细胞为激素依赖性细胞株，转染6?h后，LNCaP细胞培养基更换为含1%活性炭处理血清、1?nmol/L的二氢睾丸酮(DHT)的RPMI1640继续培养24?h。HT29细胞转染6 h后，细胞培养液更换为含1%新生牛血清的RPMI1640继续培养24?h。利用荧光倒置显微镜检测绿色荧光蛋白的表达情况。

　　2 结 果

　　2.1 TATEGFP片段的扩增及T克隆载体的构建 首先以pEGFP1载体为模板，PCR法扩增TATEGFP序列。通过2次PCR扩增得到5′ 端含Sal I酶切位点，3′端含Not I酶切位点的Sal ITATEGFPNot I小片段776?bp，PCR产物纯化后，经电泳鉴定，在650～850?bp之间有一明显条带(图1A)。将PCR扩增得到的目的片段Sal ITATEGFPNot I，经过双酶切、纯化，插入至T克隆载体，挑选4个克隆，提取质粒进行Sal I和 Not I双酶切鉴定，4个克隆在650～850?bp之间均有条带，表明均为阳性克隆(图1B)。经测序鉴定，其序列完全正确。

　　2.2 pPSATATEGFP表达载体的构建及鉴定 自含TATEGFP片段的T克隆载体中提取质粒，经Sal I和Not I双酶切，纯化得到目的小片段Sal ITATEGFPNot I。将含有PSA启动子序列的表达载体pPSAEGFP经Sal I和Not I双酶切鉴定，在720?bp左右有一条带，与EGFP片段大小符合，在10?kb处有一条带，与PSA启动子和载体序列的大小吻合(图2A)。酶切回收大片段(含PSA启动子序列和载体序列)后，进行电泳鉴定，在10?kb处有一条带，其大小与预期结果一致(图2B)。连接PSA启动子序列与TATEGFP小片段，构建pPSATATEGFP表达载体。将转化后得到的阳性克隆，进行酶切电泳鉴定，结果见图2C。测序鉴定，结果完全正确。

　　2.3 检测pPSATATEGFP的组织特异性表达情况 PSA为前列腺特异抗原，可在前列腺组织中特异表达。为了检验pPSATATEGFP是否具有组织特异性且高效表达，我们将其分别转染前列腺癌LNCaP细胞和大肠癌HT29细胞检测其表达情况，转染LNCaP细胞的结果见图3。带有PSA启动子序列的EGFP表达载体均能够在前列腺癌细胞中表达，与不含TAT序列的pPSAEGFP表达载体相比，pPSATATEGFP有较高的表达效率，但与阳性对照pEGFPN1(CMV启动子)相比，二者的表达效率均较低。转染HT29细胞的结果见图4。 无论是否带有TAT序列，PSA启动子均不能使EGFP在大肠癌细胞中表达，而阳性对照pEGFPN1在此细胞的表达水平依然较高。上述结果表明，pPSATATEGFP表达载体能够在前列腺癌细胞中特异表达，且表达水平较pPSAEGFP有所提高。pPSATATEGFP转染前列腺癌LNCaP细胞的表达情况

　　3 讨 论

　　前列腺癌演变为激素非依赖性前列腺癌后，临床缺乏有效的治疗方法。由于PSA几乎只在前列腺组织中表达，且在前列腺癌组织中高表达[6]，所以PSA是前列腺癌临床诊断治疗及预后检测的敏感指标[7]。PSA具有高度的组织特异性，本研究利用PSA的这一特性构建前列腺组织特异性表达载体[8]，将一些特异基因如抑癌基因转入前列腺中，使其能够靶向性表达。本研究结果表明，PSA启动子能够使目的蛋白EGFP在前列腺癌细胞中表达，在大肠癌细胞中基本不表达。但目的蛋白的表达效率较带有通用启动子的EGFP低，可能为我们所采用PSA启动子是5.8?kb，构建的表达载体超过10?kb，转染效率较低所致。但需要进一步构建载体进行转染实验，加以证实。

　　另外，为了进一步提高目的蛋白的表达效率，本研究在目的蛋白EGFP上游引入蛋白转导结构域TAT的序列。TAT的跨膜转运功能已多有研究报道，它能够携带分子量为15～120?kD的蛋白穿过细胞膜，使目的蛋白更好的发挥生物学功能[9]。但也有研究指出，有些蛋白与TAT结合为融合蛋白后不能在细胞间进行转导，进而不能发挥其作用[10]。本研究构建的带有TAT序列的EGFP表达载体，其表达效率确实有所提高，提示EGFP可在TAT的介导下进行跨膜转运使其提高表达效率，但提高的程度并不是很理想。

　　综上所述，采用组织特异性启动子可使目的基因进行靶向表达，TAT可使目的蛋白的表达效率提高，但提高的程度可能还依赖于目的蛋白的结构、带电性等因素。因此，采取何种方式提高目的蛋白在靶组织的表达效率仍需进一步研究探讨。

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