125I粒子组织间植入对小鼠Lewis肺癌细胞VEGFC和COX2表达影响

　作者：徐燕,刘希光,李明军 作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤中心，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 探讨125I粒子组织间植入对小鼠 Lewis肺癌细胞血管内皮生长因子C(VEGFC)和环氧化酶2(COX2)表达的影响。方法 建立小鼠Lewis肺癌模型,治疗组(n=17)在瘤体内植入2粒放射活性为9.25 MBq的125I籽源,对照组(n=16)植入2粒无放射活性的空心籽源。治疗21 d,记录小鼠的存活率;处死存活小鼠,计算肿瘤体积抑制率。摘除的肿瘤组织行常规病理学检查。采用免疫组织化学方法检测两组VEGFC和COX2表达情况。结果 治疗组和对照组小鼠存活率分别为82.35%和62.50%,差异无显著性(χ2=1.64，P>0.05); 治疗组肿瘤体积抑制率为71.13%。病理检查显示治疗组近125I籽源处肿瘤细胞变性坏死,对照组近空心籽源处可见存活肿瘤细胞。免疫组织化学显示，治疗组COX2及VEGFC表达水平低于对照组，差异有显著性(χ2=6.52、9.45，P<0.01)。结论 125I粒子组织间植入可以抑制小鼠 Lewis肺癌细胞的增殖、迁移能力,其效应可能通过抑制COX2活性进而抑制VEGFC的表达来实现。

　　【关键词】 碘放射性核素;近距离放射疗法;癌,Lewis肺;血管内皮生长因子C;环氧化酶2

　　THE INFLUENCE OF INTERSTITIAL BRACHYTHERAPY WITH 125I SEEDS ON VEGFC AND COX2 EXPRESSIONS OF Lewis LUNG CARCINOMA IN C57BL MICE XU YAN, LIU XIGUANG, LI MINGJUN (Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Mediacal College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To explore the influence of interstitial brachytherapy with 125I seeds on VEGFC and COX2 expressions of Lewis lung carcinoma in C57BL mice. Methods A Lewis lungcancer model was established. In treatment group(17 mice), two BT125IModel 125I seeds with apparent activity of 9.25 MBq were implanted into the tumor; in control group (6 mice), two dummy seeds were implanted. The survival rate of mice in both groups were recorded after 21 days of therapy. The inhibition of gross tumor volume of survived mice were measured. The tumor tissue was examined with conventional pathology. The expressions of VEGFC and COX2 were detected immunohistochemically. Results The survival rates were 82.35% in the treatment group and 62.50% in the control, the difference was not significant (χ2=1.64,P>0.05). The tumor volume inhibition rate was 71.13%. Pathological examination showed degeneration and necrosis of cancer cells at the site nearby the seed in the treatment group, but in the control group, survival cells could still be seen. Immunohistologically, the expressions of COX2 and VEGFC in the treatment group were lower than that in the control, the difference was significant (χ2=6.52,9.45;P<0.01). ConclusionThe interstitial brachytherapy with125I seeds can inhibit the growth and migration of Lewis lung cacer cells in mice. The possible mechanism may be that 125I interstitial brachytherapy can inhibit the activity of COX2,by which, expression of VEGFC and tumor angiogenesis and metastasis are suppressed.

　　[KEY WORDS] Iodine radioisotopes; Brachytherapy; Carcinoma, Lewis lung; Vascular endothelial growth factor C; Cyclooxygenase 2

　　肺癌对人类健康的危害日益严重, 但其临床治疗效果尚难令人满意,人们正在探索各种治疗方法。放射治疗已成为恶性肿瘤的主要治疗手段之一, 但传统的外照射由于放射疗法野大, 受病人的承受能力、肿瘤部位的限制等原因使这种治疗方法受到局限。125I籽源已经成功地应用于多种实体肿瘤的临床治疗, 取得了良好的治疗效果[1，2]。125I通过什么途径影响肿瘤如肺癌的转移需要进一步研究。本研究通过建立小鼠Lewis肺癌模型, 观察125I粒子组织间植入对小鼠 Lewis肺癌细胞血管内皮生长因子C(VEGFC)和环氧化酶2(COX2)表达的影响， 探讨其对肺癌可能的作用机制，为125I粒子近距离治疗肺癌提供实验依据。现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源

　　Lewis肺癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究所。实验动物为雄性C57BL近交系小鼠33只,无特定病原体(SPF)级饲养,6～8周龄,体质量18～22 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证:SCXK(京) 20020003],置于我院SPF级动物室饲养。125I粒子和无放射活性的空心籽源均由上海欣科公司提供。BT125I型125I粒子是将吸附有125I的Ag棒装在钛管中，两端采用TIG技术焊接的125I密封源，其直径为0.8 mm，长度为4.5 mm。单个源的活度为9.25 MBq，源数量共34粒。使用前高温、高压消毒。VEGFC和SABC试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。COX2系Santa Cruz公司产品。SP试剂盒均为浓缩型，购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制备 体外培养的生长活跃的Lewis肺癌细胞，经胰酶消化、收集并离心,用PBS配成2 ×1010/L 的单细胞悬液, 取0.2 mL接种于小鼠左腹股沟区皮下, SPF环境下饲养, 1周后成瘤,瘤径约5～7 mm,随机分成2组,治疗组每只小鼠肿瘤内植入2枚活度9.25 MBq的125I粒子,对照组植入空心籽源。粒子植入3周后,乙醚吸人麻醉处死小鼠,取出肿瘤组织,记录其质量与体积,计算抑瘤率。肿瘤体积计算公式为V=ab2×0.15(a为最大长径,b为横径),抑瘤率=(对照组平均体积-治疗组平均体积)/对照组平均体积×100%。肿瘤组织常规脱水、石蜡包埋、切片,苏木精伊红染色,观察细胞和组织结构变化。并行免疫组化染色。

　　1.2.2 VEGFC与COX2表达的检测 免疫组化检测两组小鼠肿瘤组织中VEGFC、COX2的表达，检测步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.2.3 结果判断 VEGFC和COX2蛋白均表达于细胞浆，呈棕黄色。在高倍镜下取5个不同视野各计数100个癌细胞，阳性细胞数>10%为阳性，阳性细胞数≤10%为阴性。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[3]统计软件分析,两组小鼠存活率、VEGFC和COX2阳性表达率的比较采用卡方检验,各组VEGFC、COX2相关性采用卡方检验，小鼠肿瘤平均体积、平均瘤质量比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 组织学检查

　　病理切片显示,有活性的籽源周边部瘤细胞损伤严重,呈弥漫性坏死,损伤程度由籽源周边部向外逐渐减弱。对照组空粒子周围肿瘤细胞轮廓清晰,生长良好,可见少量出血和坏死区。

　　2.2 小鼠存活率

　　治疗组小鼠共17只，其中死亡3只，存活率为82.35%;对照组小鼠16只，其中死亡6只，存活率为62.50%。两组比较差异无显著性(χ2=1.64，P>0.05)。

　　2.3 125I粒子植入对小鼠Lewis肺癌细胞移植瘤生长的影响

　　实验结束后，对照组移植瘤体积为(7 586.863±1 943.096)mm3，治疗组的瘤体积为(2 190.320±760.492)mm3,两组比较差异有显著性(t=10.701,P<0.01)。对照组平均瘤质量(5.902±0.967)g，治疗组为(2.536±0.912)g, 两组比较差异有显著性(t=9.803,P<0.01)。125I能明显抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤，抑瘤率为71.13%。

　　2.4 两组小鼠VEGFC、COX2表达比较

　　VEGFC阳性表达为瘤细胞浆内呈棕黄色颗粒沉淀。对照组VEGFC在Lewis肺癌细胞胞浆中呈高表达，阳性率达68.75%;而治疗组经125I组织间照射后VEGFC水平(29.41%)明显下降，差异有显著性(χ2=9.45,P<0.01)。 COX2在对照组癌组织中表达阳性，细胞浆内可见棕黄色，其阳性表达率为75.00%;而治疗组阳性表达率为41.18%，且细胞浆内为黄色颗粒。两组之间比较差异有显著性(χ2=6.52,P<0.01)。

　　2.5 COX2、VEGFC表达的相关性

　　对照组Lewis肺癌组织中12例COX2蛋白表达阳性者，其中10例VEGFC表达阳性，2例表达阴性;4例COX2蛋白表达阴性者，1例VEGFC表达阳性，3例表达阴性。两者间具有显著相关性(χ2=4.75，P<0.05)。

　　治疗组Lewis肺癌组织中7例COX2蛋白表达阳性者，其中4例VEGFC表达阳性，3例表达阴性;10例COX2蛋白表达阴性者，1例VEGFC表达阳性，9例表达阴性。两者具有显著相关性(χ2=4.41，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　组织间内照射是指将放射源植入肿瘤内或受肿瘤浸润侵犯的组织中,通过微型放射源发出的持续低能量的γ射线, 使肿瘤组织遭受最大程度的毁灭性杀伤, 使正常组织不损伤或仅有微小损伤[4～8]。与传统的外放疗相比,具有放射部位准确、放射剂量集中且不增加正常肺组织损伤的优点。多项研究表明，临床晚期癌症病人当肿瘤侵犯邻近重要组织脏器时，术中不能切除的残留肿瘤组织及淋巴通道和手术切缘处可能存在的肉眼不可见的亚临床灶，在该处植入125I粒子可获得较理想的治疗效果。近年来，125I放射性粒子在我国研制成功，已逐步应用于肺癌的治疗中，但目前对于治疗肺癌的作用机制尚处于研究阶段。

　　本实验通过建立肺癌动物模型,观察了125I粒子植入对肺癌的治疗效果,发现肿瘤组织间植入粒子经3周近距离照射后,治疗组的肿瘤体积、瘤质量均明显小于对照组;病理切片显示治疗组近粒子处肿瘤组织明显变性坏死,提示125I粒子近距离低剂量持续照射可明显地抑制肺癌细胞生长。两组的存活率差异无显著性,可能与标本例数少有关。

　　肺癌的转移是影响术后复发及5年存活率的重因素之一，其中淋巴结转移已成为评估非小细胞肺癌(NSCLC)病人预后及外科手术后选择放疗和化疗的主要指标。肿瘤细胞是通过分泌多种细胞因子来促进其自身生长和转移的。VEGFC是VEGF家族的新成员，近年来发现其有促淋巴管增殖作用。它通过作用于淋巴管内皮细胞受体Flt4诱导淋巴内皮细胞分化、增殖和迁徙，导致淋巴管增生，是肿瘤细胞和周围淋巴管内皮细胞之间相互旁分泌的重要调节因素，在淋巴结转移的发生中起着重要的作用，是一独立的预后不良因素，其表达强度与淋巴结转移和预后有密切的关系。这在头颈部肿瘤、乳癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的淋巴道转移中有相关报道，但是目前肺癌在这方面的报道甚少。

　　本研究显示，对照组VEGFC在Lewis肺癌细胞胞浆中呈高表达，而治疗组经125I组织间照射后VEGFC水平明显下降，差异有显著性。肺癌血清VEGFC水平升高是由于肿瘤负荷大，肿瘤细胞过度增生，肿瘤细胞的自分泌所致。组织间放疗后使肿瘤缩小或消失，降低了肿瘤负荷，减少了肿瘤自分泌，使 VEGFC产生受到抑制。

　　COX是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，其中 COX2亚型为可诱生型，在正常生理状态下多数组织内检测不到，而在一定因素如生长因子、炎症递质、促癌剂及一些癌基因产物等刺激下表达增加。研究表明，在上皮组织癌如：NSCLC、胃癌、直肠癌、头颈部肿瘤中普遍存在 COX2高表达，并且与肿瘤的发生、发展、转移和预后有关。COSTA等[7]研究显示，在人乳癌中COX2的表达与肿瘤淋巴结转移关系密切。本实验采用免疫组化的方法检测显示，治疗组COX2的表达明显低于对照组,差异有显著性。

　　COX2和VEGFC对肿瘤的发生发展都有着促进作用，两者在肿瘤淋巴管生成中的协同作用也已经在食管癌、胃癌和颈部鳞癌中得到了证实[4]。最近SU等[9]的研究表明，COX2可能通过EP1和HER2/Neu受体途径上调VEGFC的表达，进而促进肺癌的淋巴管生成和淋巴结转移。KYZAS等[4]的研究结果显示，头颈部鳞癌病人VEGFC与COX2的阳性表达率在有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组,且二者的共同表达是淋巴结转移惟一的预测因子。可能COX2表达上调促使癌细胞VEGFC分泌增加，VEGFC通过作用于内皮细胞上的受体VEGFR3，促进肿瘤淋巴管生成、淋巴管数目的增多，使癌细胞接触淋巴管的机会增多，从而促进肺癌淋巴结转移的发生。本研究结果显示，COX2、VEGFC及在Lewis肺癌组织中的表达均有明显的正相关，提示它们之间存在着某种内在的联系。

　　总之，本研究显示，125I组织间植入可以显著抑制Lewis肺癌细胞的生长，其分子机制可能通过抑制COX2活性，进而抑制VEGFC的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移的能力而实现的。

　　【参考文献】

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　　[8]刘希光,张传玉,杜利力,等. 125I放射性粒子植入并外照射治疗NSCLC近期效果[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(5)：393394,397.

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