β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用

作者：谭晓杰，张建立，高军 作者单位：青岛大学医学院附属医院普外科,山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT29细胞侵袭的抑制作用。方法 以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT29细胞，通过RTPCR及WesternBlot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达，MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力。结果 与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN 组中β1整合素 mRNA 和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT29细胞侵袭力均下降，但前者下降较为明显。结论 β1整合素ASODN转染HT29细胞后，通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭。

　　【关键词】 HT29细胞;抗原,CD29;寡核苷酸类,反义;转染

　　INHIBITORY ACTION OF INTEGRINβ1 ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE ON THE ADHESION AND INVASION IN HUMAN COLON CANCER TAN XIAOJIE, ZHANG JIANLI, GAO JUN (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital Of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To study the inhibitory action of integrinβ1 antisense oligonucleotide on invasion of human colon cancer cells. Methods Methods Using liposome as a vecter, integrinβ1 antisense oligonucleotide and nonoligonucleotide were transfected into human colon cancer cells, which were then randomized to ASODN group, nonantisense oligodeoxynucleotide group (NSODN) and control group. The expressions of integrinβ1 mRNA and protein were determined by RTPCR and WesternBlot, and the adhesion and invasion were measured by MTT and Transwell ventricle. Results Compared with the NSODN and blank control, the expressions of integrinβ1 mRNA and protein in the ASODN were obviously lower; the invasiveness of human colon cancer cells transfected by integrinβ1 antisense oligonucleotide and nonoligodeoxynucleotide was decreased, but the former was more obviously. Conclusion Integrinβ1 antisense oligonucleotide can inhibit invasiveness of extracellular matrix by decreasing the expression level of integrinβ1 mRNA and protein after transfecting human colon cancer cells.

　　[KEY WORDS] HT29 Cells; Antigens, CD29; Oligoribonucleotides, antisense; Transfection

　　结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，因其具有浸润、转移等恶性型的表现，即使经过积极的常规和手术根治治疗仍有部分会发生转移，其中肝转移的发生率为40%～50%,是导致病人死亡的主要原因之一[1，2]。本研究通过检测转染前后人结肠癌HT29细胞黏附力与侵袭力，观察β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对结肠癌HT29细胞侵袭的抑制作用。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料来源及分组

　　人结肠癌HT29细胞株来自同济医院胆胰外科。 试验细胞随机分成3组：ASODN组、无义寡核苷酸(NSODN)组及空白对照组。

　　1.2 主要试剂

　　β1整合素ASODN序列和NSODN序列由大连宝生物公司生产， LipofectamineTM 2000和Trizol为美国Invitrogen公司产品，RTPCR反应试剂盒由Promega公司生产，Transwell小室为COSTER公司产品。

　　1.3 人结肠癌细胞悬液的制备

　　将HT29细胞株接种于含体积分数0.10小牛血清的1640培养液(不含抗生素)中，隔天换液1次，置于37℃、体积分数0.05 CO2及95%湿度培养箱中培养,细胞融合达80%时用含质量浓度为0.2 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化传代一次，取对数生长期的细胞进行转染。

　　1.4 脂质体包裹β1整合素ASODN转染HT29细胞

　　按照LipofectamineTM 2000说明书进行操作。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测β1整合素mRNA的表达

　　转染后的HT29细胞继续培养，当生长至80%丰度时按照Trizol试剂盒的说明提取细胞总RNA，以βactin为内参照，检测β1整合素mRNA的表达情况。具体实验步骤参照文献[3]。

　　1.6 WesternBlot免疫印迹法检测β1整合素蛋白的表达

　　取转染后处于对数生长期的HT29细胞，进行WesternBlot免疫印迹试验，方法参照文献[4]。

　　1.7 体外黏附力测定

　　将Matrigel 10 μL/孔加入到24 孔培养板中,37 ℃温育1 h,加转染后的细胞悬液(104/孔),37 ℃下100 r/min离心30 min,每孔加入1 g/L MTT50 μL，37 ℃下于培养箱继续培养 4 h,每孔加入100 μL DMSO保护液,在 490 nm波长处测其吸光度值。

　　1.8 侵袭力测定

　　Transwell小室的上下室间置8 μm微孔滤膜,膜上铺Matrigel,37 ℃放置30 min,上室加入癌细胞悬液，培养箱中放置24 h,苏木精染色,光镜下计数穿过微孔滤膜的5个视野癌细胞数,并取均值。

　　1.9 统计学分析

　　数据以±s表示，采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[5]统计软件进行统计处理。

　　2 结 果

　　2.1 转染后HT29细胞中β1整合素mRNA表达

　　将转染后的HT29细胞行RTPCR反应，其产物进行电泳(以βactin作为内参照)后，3组均在290 bp处出现特异性的β1整合素mRNA条带,但ASODN 组基因表达强度低于NSODN 组和空白对照组;3组在546 bp处出现的基因条带无明显差异。见图1。

　　2.2 转染后HT29细胞中β1整合素蛋白的表达

　　3组在转染后均出现β1整合素蛋白的表达，但又不完全相同。其中与NSODN 组和空白对照组相比，ASODN组β1整合素蛋白表达强度明显降低，而NSODN 组与空白对照组之间比较无明显差异。见图2。

　　2.3 体外黏附力与侵袭力测定

　　3组细胞黏附力及侵袭力相比，差异均有显著性(F=213.05、141.21,q=5.15～27.46,P<0.01)。见表1。表1 各组细胞黏附力及侵袭力比较

　　3 讨 论

　　整合素表达高低在一定程度上反映了肿瘤细胞的生物学行为，其在肿瘤的侵袭转移过程中主要有两个方面的作用：①介导肿瘤细胞和细胞外基质的黏附，改变基质的成分，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移;②异常信息传递可促使肿瘤细胞失控性生长、去分化和远处转移。在整合素家族中与肿瘤侵袭转移关系较为密切的是β1整合素，其作为 ECM的主要受体,参与细胞的生长、发育、分化和凋亡[6]。在结肠癌组织中，β1整合素表达增强，能与基质蛋白有效结合通过酶促级联反应，提高FAK激酶活性，放大信号，使细胞增殖;另一方面，激活RasERK信号途径，保护细胞不发生凋亡，从而起到调节细胞增殖和存活的作用。由此可见，β1整合素在结肠癌的侵袭转移过程中具有重要作用，通过调节其活性或表达可能成为治疗结肠癌肝转移的一种新策略,而反义核酸技术的广泛应用使这一可能成为现实。

　　ASODN的主要作用是同特异的靶基因互补结合，阻止其转录或翻译。以反义技术攻击这些靶基因,能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,并可能延长病人的生存期[7，8]。本实验采用脂质体包裹的经硫代修饰的ASODN，具有较强的抗核酶能力，并能激活Rnase H活性，阻止mRNA的转录与翻译，抑制蛋白质的表达;脂质体携带寡核苷酸进入细胞不但增强了抗核酶的降解作用，而且延长了ASODN在细胞核内的作用时间，更好发挥其降解RNA链的作用，抑制mRNA和蛋白的表达，本文实验结果也证实了这一点。与NSODN 组和空白对照组相比较，ASODN组mRNA基因表达明显受到抑制，翻译的蛋白质产物即细胞表面的β1整合素蛋白表达水平显著下降，这就为本实验中黏附与侵袭试验等功能方面的测定提供了可靠的依据;本文黏附及侵袭试验恰恰表明，ASODN组和NSODN组均能有效抑制结肠癌细胞对细胞外基质的黏附与侵袭，效果明显优于空白对照组，但ASODN组抑瘤效果更强，更具有优越性，临床上值得推广应用。

　　总之， 本实验结果表明，β1整合素ASODN转染的人结肠癌细胞其侵袭力明显降低，这就为临床治疗结肠癌提供了新的策略，即在结肠癌根治术后可用β1整合素ASODN作为化疗辅助药物，使肿瘤细胞长期处于无症状的休眠状态，减少肿瘤的侵袭，也就减少其转移的可能性，这在临床应用方面具有一定的价值。

　　【参考文献】

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　　[2]BURCHILL S A, BRADBURG M F, PITTMAN K, et al. Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptasepolymerase chain reaction[J]. Br J Cancer, 1995,71:278.

　　[3]梁春联,王静. 免疫调节剂对1型糖尿病大鼠Foxp3表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1)：2426.

　　[4]雷炜,梁军,张彦,等. Bcl2反义寡核苷酸对小鼠肺癌细胞NCIH69放射敏感性的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1)：1518.

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　　[6]ADELSMARR M A, MCCARTHY J B, SHIMIZUR Y, et al. Stimulation of beta1integrin function by epidermal growth factor and heregulirrbeta has distinct requirements for erbB2 but a similar dependence on phosphoinositide 3OH kinase[J]. Mol Biol Cell, 1999,10:28612878.

　　[7]MARTINYBARON G, MARME D. VEGFmediated tumor angiogenesis:a new target for cancer therapy[J]. Curr Opin Biotechnol, 1995,6(6):675.

　　[8]MAREEL M, BRACKE M, VAN R F, et al. Cancer metastasis: negative regulation by an invasionsuppressor complex[J]. Cancer Detect Prev, 1995,19(5):451.