化学合成siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞E6基因表达的进一步研究

作者：史文天 王言奎，袁月秀， 罗兵 作者单位：1 青岛大学医学院附属医院妇产科，山东 青岛 266003; 2 青岛大学医学院微生物学教研室

　　【摘要】 目的 探讨靶向HPV16 E6基因特异性siRNA对SiHa细胞E6和E7基因表达的沉默效果，以及沉默作用对pRb、P53、Survivin和VEGFC蛋白表达的影响。方法 化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA，脂质体法转染SiHa细胞。半定量RTPCR检测siRNA对SiHa细胞E6和E7基因转录表达的影响;Western Blotting法检测pRb、P53、Survivin和VEGFC蛋白的表达。结果 RTPCR检测结果显示，转染siRNA后24、48和72 h组SiHa细胞E6和E7 mRNA表达水平均明显低于对照组(F=80.71、182.18，P<0.05)。Western Blotting结果显示,与对照组相比，转染组pRb和P53蛋白表达明显升高(F=59.78、29.00，P<0.05)，VEGFC蛋白表达明显降低(F=7.58，P<0.05)，Survivin蛋白的表达则没有发生明显变化(F=2.28，P>0.05)。结论 HPV16 E6特异性siRNA能同时抑制SiHa细胞内E6和E7基因的表达，进而引起P53、pRb以及VEGFC蛋白表达水平的改变。

　　【关键词】 E6基因;E7基因;RNA，小分子干扰;人乳头瘤病毒

　　A FURTHER STUDY OF SILENCING E6 GENE IN CERVICAL CANCER CELL LINE SiHa WITH CHEMICALLY SYNTHETICsiRNA SHI WENTIAN, WANG YANKUI, YUAN YUEXIU, et al (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To investigate the silencing effects of E6 and E7 oncogenes on SiHa cells by transfection with HPV16 E6 specific siRNA and the expressions of proteins pRb, P53, Survivin and VEGFC induced by the silencing effects.Methods The chemically synthetic siRNA targeting HPV16 E6 gene was transfected into SiHa cells via LipofectamineTM 2000. E6 and E7 mRNA levels were then detected by RTPCR. Western Blotting was applied to examine the expressions pRb, P53, Survivin and VEGFC. Results E6 and E7 mRNA expressions at 24 h, 48 h and 72 h posttransfection were decreased as compared with control groups (F=80.71,182.18;P<0.05). Compared with control groups, P53 and pRb expressions of posttransfection group increased (F=59.78,29.00;P<0.05) and VEGFC decreased (F=7.58,P<0.05). The expression of Survivin in posttransfection group had no difference compared with control groups (F=2.28,P>0.05). Conclusion E6 gene specific siRNA can simultaneously suppress E6 and E7 expressions and thus provoke the changes of expression levels of cellular P53, pRb and VEGFC.

　　[KEY WORDS] E6 gene; E7 gene; RNA, small interfering; Human papillomaviruse

　　高危型人乳头瘤病毒(HRHPV)感染是引起宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要因素，超过2/3的宫颈癌病人的发生与HPV16/18感染密切相关[1]。HRHPV早期转录区E6、E7基因的表达产物E6和E7蛋白在肿瘤的发生、细胞周期调控及凋亡调节中起重要作用，是宫颈癌发生和发展的重要原因。由于HPV的E6/E7基因是引发宫颈癌并维持恶性表型的关键因素，而且基因序列与人类自身基因之间没有同源性，因此，以E6/E7基因为靶标的生物治疗具有更强的靶向性。本研究在前期实验[2]的基础上，选用其中的一条具有最佳干涉效果的靶向HPV16 E6基因的siRNA，转染HPV16表达阳性的人宫颈鳞癌SiHa细胞系，探讨E6基因沉默后SiHa细胞在分子水平上的改变，为深入探讨宫颈癌的发病机制提供理论依据。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料与试剂

　　SiHa细胞由本院微生物学教研室保存并提供。DMEM购自美国Gibco公司。脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂和RNA提取试剂TRIzol均购自美国Invitrogen公司。RT试剂盒购自美国Promega公司。兔抗pRb多克隆抗体和兔抗VEGFC多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠抗P53多克隆抗体、兔抗Survivin多克隆抗体以及浓缩型DAB显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗βactin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。

　　1.2 siRNA设计合成

　　靶向HPV16 E6基因的特异siRNA序列为：正义链5′GAGCUGCAAACAACUAUAC3′，反义链3′CUCGACGUUUGUUGAUAUG5′。广州锐博生物技术公司合成，PAGE纯化。靶位点位于E6基因的第73～91位碱基，经BLAST软件筛查分析，证明与人类自身编码序列无同源性。

　　1.3 siRNA转染

　　SiHa细胞采用含体积分数0.10的胎牛血清、100 mg/L链霉素及100 kU/L青霉素的DMEM培养液于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。转染前1 d将SiHa细胞传代于6孔细胞培养板中培养，当细胞汇合度达到40%左右，按LipofectamineTM2000转染试剂盒要求进行转染，siRNA的转染终浓度为50 nmol/L[2]。转染后6～8 h更换为含血清的完全培养基继续培养。

　　1.4 半定量RTPCR检测SiHa细胞E6和E7 mRNA的表达

　　1.4.1 引物的设计合成 使用Premier 5.0软件设计HPV16 E6、E7基因和内参照GAPDH基因的特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列及扩增产物大小见表1。表1 RTPCR所用引物的序列及扩增片段的大小引物引物序列扩增产物大

　　1.4.2 RTPCR 收集细胞对照组、脂质体对照组以及转染后24、48和72 h组细胞，TRIzol一步法提取各组细胞总RNA。按逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA，用作PCR扩增模板。PCR反应体系包括：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，0.2 mmol/L dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U，cDNA 4 μL，去离子水补至25 μL。E6扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。E7扩增条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，50℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳后，用凝胶自动成像系统分析各电泳条带吸光度(A) 值。以E6/GAPDH、E7/GAPDH的吸光度比值分别表示E6和E7 mRNA的表达水平[3]。

　　1.5 Western Blotting法检测P53、pRb、Survivin和VEGFC蛋白的表达情况

　　收集对照组细胞、脂质体对照组以及转染后72 h细胞，组织裂解液法提取细胞总蛋白。取50～100 μg的蛋白行SDSPAGE凝胶电泳;电转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h;分别加兔抗pRb (1∶200)、鼠抗P53 (1∶100)、兔抗VEGFC (1∶200)、兔抗Survivin (1∶200)及兔抗βactin单抗 (1∶300)，4 ℃孵育12 h，TBS溶液洗膜3次，每次15 min;加酶标羊抗兔IgG (1∶300)或酶标羊抗鼠IgG (1∶500)，室温振荡孵育2 h，TBS洗膜;加DAB显色剂室温作用1～3 min，暗室内X线胶片曝光5 min后显影定影并观察结果。

　　1.6 统计学分析

　　结果用±s表示，使用SPSS 13.0及PPMS 1.5[4]统计分析软件对各组数据行单因素组间方差分析，以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR检测转染后SiHa细胞E6和E7 mRNA的表达

　　对照组、脂质体对照组、转染24 h组、转染48 h组及转染72 h组E6 mRNA的表达水平分别为0.357±0.047、0.383±0.052、0.132±0.016、0.155±0.020，E7 mRNA的表达水平分别为0.540±0.044、0.571±0.039、0.206±0.026、0.188±0.029、0.238±0.030。转染siRNA后24、48和72 h组E6和E7 mRNA的表达水平明显低于对照组(F=80.71、182.18，P<0.05);对照组和脂质体对照组间SiHa细胞E6和E7 mRNA的表达水平无明显差异(P>0.05)。

　　2.2 Western Blotting检测PRb、P53、Survivin和VEGFC蛋白的表达

　　对照组、脂质体对照组、转染72 h组pRb的表达分别为0.405±0.029、0.404±0.038、0.713±0.064，P53的表达分别为0.634±0.050、0.622±0.077、1.269±0.087，Survivin的表达分别为0.965±0.081、1.024±0.064、0.926±0.047，VEGFC的表达分别为0.416±0.061、0.407±0.055、0.290±0.032。与对照组相比，转染72 h组SiHa细胞内pRb和P53蛋白的表达增加(F=59.78、29.00，P<0.05)，VEGFC蛋白的表达减少(F=7.58，P<0.05)，Survivin蛋白的表达则未发生明显变化(F=2.28，P>0.05)。对照组和脂质体对照组间SiHa细胞各蛋白的表达无明显差异(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　E6蛋白与野生型P53蛋白的结合可使P53蛋白通过泛素蛋白酶体通路降解，从而启动细胞周期并抑制细胞凋亡，细胞过度增殖而导致肿瘤的发生。E7蛋白通过结构上的pRb结合位点，优先与pRb结合并使其磷酸化，使RbE2F复合物解离，E2F游离，导致细胞周期调控失控，发生永生化。同时，由于E6和E7基因与人类自身基因序列之间无同源性，因此，E6和E7基因是进行HPV阳性宫颈癌基因治疗研究的理想靶点。我们前期的研究工作证实，脂质体法转染化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA，能特异性沉默HPV16阳性肿瘤细胞SiHa中E6基因的转录表达，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡;且不同siRNA对靶基因的特定序列具有较强的选择偏向性和浓度依赖性[2]。

　　E6/E7基因转录后位于同一条mRNA上，二者共用同一个启动子和一个早期多聚腺苷位点，因此被称为双顺反子E6E7 mRNA(bicistronic E6E7 mRNA)[5]。本研究所用的siRNA转染SiHa细胞后，在抑制E6 mRNA表达的同时，也能够有效抑制E7 mRNA的表达，提示E6和E7基因之间存在着联合抑制的情况。该结果和其他一些实验的结果不尽相符。JIANG等[6]实验表明，E6 siRNA不影响E7基因的表达，E7 siRNA不影响E6基因的表达。BUTZ等[7]构建表达HPV18 E6 siRNA的载体，能特异性地抑制E6基因的表达，不影响E7基因的表达。这可能是与干涉位点的选择、siRNA的浓度差异以及不同靶细胞的选择有关。

　　Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一员，是迄今为止发现的最强的细胞凋亡抑制因子。FROST等[8]研究显示，在Survivin阳性的CINⅠ级组织中，同时感染HPV的标本出现Survivin强阳性，而无HPV感染的只是Survivin中度阳性;在乳头瘤中Survivin和HPV表现出共同的细胞定位。推测HPV可能直接或间接地调节Survivin的表达和细胞分布，两者对宫颈癌发生可能起着协同作用。目前两因子协同致癌的具体机制尚不清楚，考虑与P53和pRb抑癌途径相关。野生型P53蛋白能下调Survivin的表达，若p53突变则丧失此作用而导致Survivin高表达[9]。还有研究显示，Survivin与CDK4结合形成复合物，使pRb磷酸化从而发挥抗凋亡作用[10]。本研究结果表明，E6和E7基因特异性沉默可使SiHa细胞内抑癌蛋白P53和pRb表达上调，部分恢复了P53和pRb抑癌途径。但是Survivin蛋白的表达水平在转染前后并未发生明显变化，不能证明二者之间存在着协同作用，可能的原因如下。①化学合成siRNA存在易降解、作用持续时间短暂的不足，无法完全沉默目的基因的表达。本实验对E6和E7基因转录后表达的抑制效率在60%左右，细胞内还有部分E6和E7蛋白的表达，仍可促进Survivin的表达。②可能存在其他不依赖HPV的激活Survivin基因表达的途径。

　　VEGFC是目前为止发现的最具特异性的淋巴管内皮细胞生长刺激因子，可促进肿瘤淋巴管内皮细胞的迁移和增殖。SU等[11]研究显示，COX2表达可显著上调VEGFC蛋白的表达，COX2表达受抑也可减弱VEGFC蛋白表达水平。而E6和E7蛋白通过抑制P53和pRb抑癌途径，可上调细胞内COX2基因表达[12,13]。本研究结果显示，SiHa细胞内抑癌蛋白P53和pRb表达上调可导致VEGFC蛋白表达减少，提示HRHPV和VEGFC在宫颈癌发生过程中可能起着协同作用，E6和E7蛋白在诱导宫颈上皮细胞生长增殖失控过程中可能通过导致VEGFC基因的异常高表达，进而影响肿瘤细胞的转移和扩散。

　　总之，本研究结果表明，E6和E7基因表达的沉默可导致细胞内某些抑癌基因和癌基因等表达的改变，对肿瘤的细胞周期、凋亡、转移扩散等各个方面造成广泛的影响，并导致肿瘤细胞内部调节分裂增殖细胞因子的异常表达趋向于正常。

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