用MTT比色法建立B型CpG ODN活性检测标准

　　作者：王学菊, 刘璟, 万敏, 王莉, 吴秀丽, 卫红飞, 于永利*, 王丽颖* 作者单位：吉林大学基础医学院: 分子生物学教研室, 免疫学教研室, 吉林 长春 130021

　　【摘要】 　　目的: B型CpG ODN, BW006作为疫苗佐剂已进入临床试验阶段, 所以需要建立稳定、 安全、 简便易行的活性检测方法以控制不同批次BW006的生产质量。方法: 根据BW006具有刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生的特点, 选择无放射性污染的MTT比色法作为首选检测方案。用BW006刺激BALB/c小鼠脾细胞作为筛选平台, 确定如下反应条件: 脾细胞用量、 培养板形状、 BW006浓度、 培养液体积和培养时间以及如何优化MTT检测过程以提高反应灵敏度。结果: 用3mg/L BW006与96孔平底板中含100mL/L FBS的200μL无酚红RPMI1640培养的6×105个小鼠脾细胞在37℃ 含50 mL/L CO2孵箱中共孵育36 h。随后每孔弃100 μL上清, 加入MTT(5g/L) 10μL, 37℃避光孵育4 h使各孔充分形成甲瓒颗粒。每孔加入DMSO 150μL, 经平板振荡器振荡20 min至颗粒完全溶解, 在酶标仪上检测A578值即可。结论: 建立了无污染、 造价低、 可操作性强的BW006活性检测方法。

　　【关键词】 MTT比色法 脾细胞增生 BW006 活性

　　Determination of optimized MTT colorimetric assay as the identification method for the activity of B type CpG ODN BW006

　　WANG Xueju, LIU Jing, WAN Min, WANG Li, WU Xiuli, WEI Hongfei, YU Yongli*, WANG Liying*

　　Department of Molecular Biology, Department of Immunology, College of Basic Medicine, Jilin University, Changchun 130021, China

　　[Abstract] AIM: BW006, B type CpG ODN, will be approved as vaccine adjuvant for human use. So it is necessary to determine a stable, safety and easytooperate method for activity identification of BW006 with different lots. METHODS: According to the characteristic of BW006 to stimulate the proliferation of PBMC or mice splenocytes, MTT assay was preferentially selected to test the characteristic of BW006. The splenocytes of female BALB/c mice was stimulated by BW006, and different experiment parameters including splenocyte numbers, the shape of plate, BW006 concentration, culture medium, culture time and optimized MTT conditions were determined in these courses. RESULTS: the whole experiment scheme was defined as following: 6×105 splenocytes were cocultured with 3 mg/L BW006 in 200 microliter RPMI1640(without phenol red) supplemented with 100 mL/L FBS in a 96 well square plate. PBS, the solvent of BW006 was used as negative control, and culture medium without cells was used as blank. After being cocultured for 36 hours at 37℃ in humidified incubator with 50 mL/L CO2, 100 microliter supernatants was aspired out and 10 microliter MTT (5 g/L) was added into each well. The plate was further incubated in dark at 37℃ for 4 hours that is sufficient for the formation of formazan. Afterward, 150 microliter DMSO was directly added into each well. The plate was shaken on plate shaker for nearly 20 minutes until the formazan was completely dissolved and detected A578 value at at ELISA reader. CONCLUSION: optimized MTT assay, which is nonradioactive contamination, lowprice and simple operation, could be used as activity identification of BW006 during largescale production.

　　[Keywords]MTT assay; proliferation; BW006; activity

　　CpG ODN, 是人工合成的含有未甲基化CG基序的单链寡聚脱氧核苷酸, 可以模仿细菌或病毒对脊椎动物免疫系统的刺激作用[1]。根据作用特点的差别, CpG ODN可被分成三类[2], 其中B类CpG ODN能刺激B细胞增生和活化, 目前已被大规模应用在疫苗佐剂研究中[1, 3]。BW006是由本室构建并已申请国家专利的B型CpG ODN。小鼠体内实验证明BW006作为狂犬疫苗佐剂, 可以替代铝佐剂, 促进抗体提前产生, 减少疫苗注射次数; 作为乙肝疫苗佐剂, 可以协同铝盐, 增效HBsAg免疫原性; 作为流感疫苗佐剂, 可以减低疫苗用量(以上实验结果由本室完成, 尚未发表)。目前已进入临床活性评价阶段, 为此需要建立简便易行的活性鉴定方法以检测不同生产批次的BW006质量。四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法是检测细胞增生的方法之一[4], 基本原理为活细胞内琥珀酸脱氢酶可使黄色的MTT还原产生蓝紫色甲瓒颗粒, 后者可溶于有机溶剂, 在酶标仪上检测A578值即可。具有快速、 无污染、 操作简便等特点, 但灵敏度较低。本研究中首次尝试通过优化MTT比色法, 检测BW006刺激免疫细胞增生的能力, 以建立稳定的BW006的活性检测标准。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BW006由TaKaRa合成。6～8周龄的雌性BALB/c小鼠购自吉林大学基础医学院动物室。96孔圆底板和平底板购自Costar公司。无酚红RPMI1640购自Hyclone公司。标准胎牛血清(FBS)购自天冿TBD公司。MTT粉末购自Sigma公司。DMSO购自天津市光复精细化工研究所。TS1型脱色摇床由江苏海门市麒麟医用仪器厂生产。CO2培养箱为德国Heraeus公司产品。扫描仪为清华紫光公司产品。Multiskan Ascent型酶标仪由芬兰Thermo Labsystems公司生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 摸索最佳铺板的脾细胞数 分别在96孔圆底板中加入如下细胞数(/孔): 12×105、 6×105、 3×105、 1.5×105和0.75×105, 每一个细胞梯度中均加入BW006致1 mg/L(5复孔), PBS为BW006溶媒对照。用200 μL含100 mL/L FBS的无酚红RPMI1640培养[5]。为避免边缘效应的产生, 培养板周围各孔中只加入200 μL无菌PBS[6]。37℃细胞培养箱孵育60h。1200 r/min水平离心机离心10min, 每孔中弃100μL培养上清, 然后加入10μL MTT(5g/L)。37℃避光孵育4h。1200 r/min水平离心机离心10 min, 每孔中弃80 μL培养上清后加入200 μL DMSO。平板振荡器上振荡, 约4 h后孔底结晶颗粒消失, 用酶标仪检测A578值。

　　1.2.2 简化DMSO加入条件 用含100 mL/L FBS的100 μL RPMI1640培养脾细胞。刺激时间结束后, 在每孔中直接加入10 μL MTT(5 g/L)。37℃避光孵育4 h后不弃上清, 分别加入100 μL或150 μL DMSO。振荡溶解20 min, 扫描平板, 酶标仪检测A578值。

　　1.2.3 比较培养液用量对细胞培养的影响 分别用100 μL或200 μL培养液培养BW006刺激的脾细胞。刺激结束后, 在200 μL培养孔中弃100 μL上清。各孔中加MTT的量同上。避光孵育结束后, 分别直接加入100 μL或150 μL DMSO。振荡溶解20 min, 扫描平板, 检测A578值。

　　1.2.4 摸索BW006刺激脾细胞增生的量效和时效关系 (1)量效关系实验: 分别用0.75、 1.5、 3、 6、 12、 24、 48和96 mg/L BW006刺激脾细胞, 刺激60 h后, 1200 r/min离心10 min, 每孔弃100 μL培养上清, 加入10 μL MTT(5 g/L)。37℃避光孵育4 h后, 每孔中加入150 μL DMSO。震荡溶解20 min, 酶标仪检测A578值; (2)时效关系实验: 为保证各检测时间点刺激结果的可比性, 在同一96孔平底板上, 用3 mg/L BW006分别刺激BALB/c小鼠脾细胞24、 36、 60、 72、 96和108 h。同一时间点结束实验, MTT检测同(1)。

　　2 结果

　　2.1 最佳铺板脾细胞数的确定 在96孔圆底培养板中加入不同数量的小鼠脾细胞, 观察BW006刺激细胞的增生情况(图1), 结果表明: 每孔6×105细胞在BW006刺激下增生幅度最大, 由此确定, 6×105为最佳用于检测BW006活性的铺板细胞数。但是, 加入MTT后形成的甲瓒(Formazan)颗粒即使震荡4 h, 仍不能完全溶解。复孔间A值误差大, 推测可能为脾细胞在U型板底聚集使得颗粒溶解不彻底。以下实验中改用平底板培养脾细胞, 以减少溶解不彻底造成的误差。

　　图1 最佳脾细胞数的确定(略)

　　Fig 1 Determination of optimal splenocytes numbers

　　2.2 实验体系的优化 在上述反应体系中, 加入DMSO溶解颗粒之前需要吸弃部分培养液, 为了减少由此步操作对实验造成误差的可能性, 在100 μL培养液中直接加入DMSO。结果发现, 100 μL DMSO不足以完全溶解formazan颗粒, 而150 μL DMSO直接加入含100 μL培养液中可完全溶解MTT所形成的formazan颗粒, A值远远高于100 μL DMSO孔(图2)。

　　图2 简化MTT反应体系的尝试(略)

　　Fig 2 Exploration of simplified MTT method

　　2.3 实验体系的确定 为了进一步确定BW006刺激小鼠脾细胞的MTT反应条件, 采用等量BW006刺激小鼠脾细胞, 观察不同体积的培养液和DMSO对测定A值的影响, 结果显示: 用含100 mL/L FBS的 200 μL RPMI1640培养脾细胞、 150 μL DMSO溶解Formazan颗粒可以获得最佳结果(图3)。因此, BW006刺激小鼠脾细胞的MTT反应条件确定为: 96孔平底培养板, 每孔6×105小鼠脾细胞, 含100 mL/L FBS的200 μL无酚红RPMI1640培养液。BW006刺激结束后, 每孔中弃100 μL培养上清, 加入10 μL MTT(5 g/L); 37℃避光孵育4 h; 加入150 μL DMSO, 震荡溶解20 min; 用酶标仪检测A578值。

　　图3 BW006刺激脾细胞增生的MTT反应条件的确定(略)

　　Fig 3 Determination of experimental conditions of MTT assay

　　2.4 BW006刺激脾细胞增生的量效关系 为了观察BW006剂量与小鼠脾细胞增生之间的关系, 采用0.75、 1.5、 3、 6、 12、 24、 48和96 mg/L BW006刺激小鼠脾细胞, 然后用MTT法检测, 结果表明, 0.75 mg/L BW006已具有刺激脾细胞增生的能力, 3 mg/L或6 mg/L的刺激能力最强(图4), 随着浓度继续增大, 刺激能力平缓下降。因此, 确定3 mg/L用于BW006活性的鉴定。

　　图4 BW006刺激小鼠脾细胞增生的量效关系(略)

　　Fig 4 The dose effect of BW006 to stimulate the proliferation of mice splenocytes

　　2.5 BW006刺激脾细胞增生的时效关系 为了确定BW006对小鼠脾细胞的最佳刺激时间, 采用3 mg/L BW006对小鼠脾细胞分别刺激24～108 h, MTT法检测细胞的增生情况, 结果(图5), BW006刺激36 h的脾细胞增生最明显, 以后随着时间的延长而增生程度逐渐减缓。

　　图5 BW006刺激小鼠脾细胞增生的时效曲线(略)

　　Fig 5 The time curve of BW006 to stimulate the proliferation of mice splenocytes

　　3 讨论

　　近年来, 由我室构建的B型CpG ODN BW006在作为很多商品疫苗(狂犬, 乙肝和流感)佐剂研究中, 发挥明确的增效作用, 已被开发为商品化的核酸类佐剂(资料未公开)。投入规模化生产后, 需要建立简便、 经济、 无污染的BW006活性检测标准, 以保证临床使用中的质量。根据B型CpG ODN的功能特点, 即刺激哺乳动物免疫细胞增生活化(主要为B淋巴细胞), 可以采用3H掺入[2, 7]、 MTT比色法检测小鼠脾细胞的增生或是流式细胞术检测B细胞的活化[8]。 3H掺入法比MTT比色法灵敏度高, 但容易造成放射性污染; 检测B细胞活化需要应用流式细胞术和荧光抗体, 但费用昂贵、 主观因素影响大。而MTT比色法具有操作简单、 无污染、 造价低等特点, 符合规模化检测的基本要求。本实验中, 用BW006作为刺激物, 对MTT检测过程中的各个关键参数进行筛选, 确定了优化的MTT检测体系: 用200 μL含100 mL/L FBS的无酚红RPMI1640培养液和96孔平底板培养细胞; 确定6×105个6～8周的健康雌性BALB/c纯系小鼠脾细胞作为每孔细胞用量; 刺激结束后, 1200 r/min离心10 min, 每孔弃100 μL培养上清, 加入10 μL MTT(5 g/L)。37℃孵箱避光孵育4 h, 加入150 μL DMSO, 平板振荡器振荡20 min, 酶标仪检测A578值。在此基础上确定了BW006刺激小鼠脾细胞增生的最佳工作浓度为3 mg/L; 最佳刺激时间为36 h。经优化的MTT比色法具有灵敏度高、 背景低的特点, 可以完全满足活性检测的需要, 从而避免了环境污染和成本过高等问题。然而, MTT比色法仍不能取代3H掺入法在CpG ODN实验室大规模筛选中的作用以及FCM检测在CpG ODN免疫活性鉴定中的作用。

　　【参考文献】

　　[1] Krieg AM. Therapeutic potential of Tolllike receptor 9 activation[J]. Nat Rev Drug Discov, 2006, 5(6): 471-484.

　　[2] 王学菊, 王智博, 卫红飞, 等. C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(4): 338-342.

　　[3] Guy B. The perfect mix: recent progress in adjuvant research[J]. Nat Rev Microbiol, 2007, 5(7): 505-517.

　　[4] Lin DS. Comparison of three nonradioactive assays for measurement of cellmediated immunity[J]. Bio Formosa, 2006, 41(2): 59-66.

　　[5] Meletiadis J, Mouton JW, Meisjf GM, et al. Comparison of spectrophotometric and visual readings of NCCLS method and evaluation of a colorimetric method based on reduction of a soluble tetrazolium salt, 2, 3bis[2methoxy4nitro5[(sulfenylamino) carbonyl]2Htetrazoliumhydroxide], for antifungal susceptibility testing of aspergillus species[J]. J Cin Microbiol, 2001, 39(12): 4256-4263.

　　[6] Patel MI, Tuckerman R, Dong QH. A Pitfall of the 3(4, 5dimethylthiazol2yl)5(3carboxymethonyphenol)2(4sulfophenyl)2Htetrazolium (MTS) assay due to evaporation in wells on the edge of a 96 well plate[J]. Biotechnology Letters, 2005, 27(11): 805-808.

　　[7] Mannon RB, Nataraj C, Pisetsky DS. Stimulation of thymocyte proliferation by phosphorothioate DNA oligonucleotides[J]. Cell Immunol, 2000, 201(1): 14-21.

　　[8] Krieg AM, Yi AK, Matson S, et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct Bcell activation[J]. Nature, 1995, 374(6522): 546-549.