人细胞因子受体样因子3在真核及原核细胞中的表达

作者：赵艳, 段素素, 车昌艳, 张蕾, 张云, 王树蕙, 刘力 作者单位：中国医学科学院 基础医学研究所 病原微生物学系, 北京 100005

　　【摘要】 　　目的: 观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位, 并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白。方法: 将真核表达载体pCMVmycCRLF3瞬时转染293T细胞, 转染24 h和48 h后免疫荧光染色, 共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位; 构建原核表达质粒pGEX4T1CRLF3, 实现插入基因的融合表达, 经GST亲合层析纯化蛋白。结果: CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达, 主要分布在细胞质和细胞膜; 成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体, 并在大肠杆菌内高效表达, 纯化后得到Mr 约为74000的融合蛋白。结论: 在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜; 获得了重组GSTCRLF3融合蛋白,为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础。

　　【关键词】 人细胞因子受体样因子3 真核表达 原核表达 蛋白纯化

　　The expression of human cytokine receptorlike factor 3 in mammalian and E.coli cells

　　ZHAO Yan, DUAN Susu, CHE Changyan, ZHANG Lei, ZHANG Yun, WANG Shuhui, LIU Li

　　Department of Microbiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China

　　[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography. RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.

　　[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification

　　人细胞因子受体样因子3(cytokine receptorlike factor 3, CRLF3)是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的新基因。本实验室从K562细胞中克隆出CRLF3[1], 并提交NCBI GenBank(DQ298450)。CRLF3基因编码区全长1317 bp, 编码一个438个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析CRLF3定位在17q11.2, 具有一个重要的结构域——FN3功能域, 这一结构域的C末端, 有一个RGD基序和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序, CRLF3基因保守存在于多种生物中。对CRLF3的功能研究表明CRLF3 的过表达可以抑制细胞周期, 使细胞停滞在G0/G1期, 减少了进入S期的细胞, 其作用机制尚不明确。CRLF3可能是一种交通信号分子。本研究中, 我们将CRLF3基因在真核细胞中表达, 观察了CRLF3在真核细胞中的定位, 并在原核细胞中表达和纯化了其融合蛋白, 为进一步研究CRLF3的功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 真核表达质粒pCMVmycCRLF3、 人胚肾293T细胞、 融合表达载体pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清购自Gibco公司; T4连接酶、 BamH I、 Xho I限制性内切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均购自TaKaRa公司; 磷酸钙转染试剂购自碧云天生物技术公司; cMyc抗体购自Santa Cruz公司; FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司; GSTTag抗体购自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技术公司合成; 其他均为国产分析纯生化试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 293T细胞的培养和pCMVmycCRLF3的转染 将生长状态良好的293T细胞按1×105 cells/孔的密度转移到放玻片的6孔板中, 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培养基中培养24 h。转染前30 min, 换新鲜的培养液2 mL, 分别取5 μg空载体质粒和pCMVmycCRLF3与磷酸钙转染试剂混匀, 室温孵育20 min, 均匀滴加到6孔板内, 在50 mL/LCO2, 37℃培养箱内培养24 h和48 h。

　　1.2.2 免疫荧光染色 转染24 h和48 h后, 弃去培养液, 多聚甲醛固定20 min, 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封闭1 h, 加入抗cmyc抗体(1∶100)室温孵育1 h, PBST充分洗涤。加入FITC标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)室温孵育1～2 h, PBST充分洗涤。最后加入0.5 g/L DAPI(联眯基苯吲哚酸盐)标记细胞核15min, 洗涤后500mL/L甘油封片, 共聚焦显微镜观察结果。

　　1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表达载体的构建 以本室构建的pCMVmycCRLF3质粒为模板, 根据已测得的CRLF3的全长序列设计引物, 进行PCR扩增。上游引物序列为5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′, 其中导人BamH I酶切位点; 下游引物序列为5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′, 其中导人Xho I酶切位点。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳回收, BamH I和Xho I酶切pGEX4T1载体和PCR产物, T4连接酶连接, 转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5 mL LB(Amp+)培养液中培养过夜, 提取重组质粒, BamH I/Xho I酶切鉴定, 阳性克隆提交上海英俊生物技术公司进行测序分析。

　　1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的诱导表达和纯化 将序列正确的重组表达质粒pGEX4T1CRLF3转化宿主菌BL21(DE3), 挑选5个单个菌落分别接种到5 mL LB(Amp+)管中, 与37℃剧烈摇动培养过夜。每个菌落的培养物按1/100的比例接种到2个新鲜LB(Amp+)管中, 37℃剧烈摇动培养4 h, A550达到0.6～0.8后, 向其中一管中加入终浓度为1 mmol/L IPTG, 另一管为未诱导的对照菌, 30℃继续培养3～4 h。离心收集培养液各1 mL, 菌体沉淀以100 μL PBS重悬, 取10 μL样品进行120 g/L SDSPAGE电泳, 考马斯亮蓝染色。以空载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照, 检测蛋白表达情况, 选出蛋白表达量高的菌落做种子。

　　1.2.5 融合蛋白的大量表达和纯化 选取融合蛋白表达量高的种子菌, 以终浓度为1 mmol/L IPTG大量诱导菌液500 mL, 离心收集菌体, 1×PBS(pH7.4)悬浮菌体, 冰浴条件下超声破裂菌体, 4℃、 120000 r/min离心30 min, 取少量上清和沉淀, 进行SDSPAGE检测, 分析蛋白质在胞内表达形式。确定目的蛋白以可溶性形式存在后, 取超声上清过装有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝胶的纯化柱, 以1 L的PBS淋洗, 去除杂蛋白, 最后用1倍柱体积的GST洗脱缓冲液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0, 10 mmol/L还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白。

　　1.2.6 Western blot鉴定融合蛋白 取纯化的蛋白进行120 g/L丙烯酰胺凝胶电泳, 电转移至硝酸纤维素膜上, 50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜。加入GST抗体(1∶2500)室温孵育2 h, TBST充分洗涤, 加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5000), 室温孵育1 h, TBST充分洗涤, ECL显影。

　　2 结果

　　2.1 共聚焦显微镜观察结果 采用共聚焦显微镜观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及分布。以转染pCMVmyc空载体的293T细胞为本底对照, 40倍物镜下观察可见CRLF3在真核细胞中高效表达。油镜下观察可见瞬时转染24h后的CRLF3均匀分布在胞质中; 瞬时转染48 h后的CRLF3分布在细胞质和细胞膜上(图1)。

　　图1 转染24 h和48 h后免疫荧光染色(略)

　　Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)

　　A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.

　　2.2 重组质粒的构建和鉴定 以pCMVmycCRLF3质粒为模板扩增的产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 得到一条特异条带, 与目的片段1318 bp的大小位置相符(图2)。重组质粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鉴定(图3), DNA测序分析, 证明插入序列是目的序列, 且与融合表达载体的读码框相符。

　　图2 CRLF3 PCR扩增产物(略)

　　Fig 2 CRLF3 product of PCR

　　1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.

　　图3 重组质粒pGEX4T1CRLF3的酶切鉴定(略)

　　Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3

　　1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.

　　2.3 重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达和纯化 SDSPAGE结果显示, 转化空载体的对照组BL21 IPTG诱导后, 在Mr 26000的位置上出现1条浓集带; 转化pGEX4T1CRLF3重组质粒的BL21 IPTG诱导后, 在Mr约为74000的位置上出现1条较浓集而且表达量受IPTG诱导的蛋白条带, 说明插人的融合基因已经在大肠杆菌中表达, 但在这一位点上也有内源性基因的表达。超声破碎菌体并离心后, 分别取上清和沉淀进行SDSPAGE电泳检测, 显示目的蛋白主要在上清液中, 它在菌体内主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化目的蛋白, SDSPAGE分析得到1条Mr为74000的单一条带。灰度扫描分析, 纯度达到85%(图4)。

　　图4 SDSPAGE分析融合蛋白的表达及纯化(略)

　　Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein

　　1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21(IPTG-); 3: pGEX4T1 transformed BL21(IPTG+); 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21(IPTG-); 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21(IPTG+); 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.

　　2.4 Western blot检测 用抗GSTtag多克隆抗体对纯化的GSTCRLF3融合蛋白进行Western blot检测。抗GST的抗体可以检测到Mr为74000的CRLF3融合蛋白条带, 提示纯化后的蛋白为所需要的GST融合蛋白。

　　3 讨论

　　CRLF3基因定位在17q11.2, 邻近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因, 在神经纤维瘤患者中, CRLF3基因常与NF1一起缺失。神经纤维瘤的遗传学致病机制是由于NF1基因的微缺失, 其缺失的范围至少包括11个基因, CRLF3为其中之一[2, 3]。NF1基因是一种抑癌基因[4], 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。对CRLF3的生物信息学预测, 它不具有跨膜结构域, 没有核定位信号与细胞器定位信号, 是一种胞质蛋白质。本研究中通过在真核细胞中表达CRLF3, 可见CRLF3转染24 h后主要定位在细胞质, 转染48 h后, 则在细胞质和细胞膜上均有分布, 提示在真核细胞中过表达的CRLF3是一种胞质蛋白质, 充分表达后向细胞膜迁移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序, 含有这样结构域的分子大部分具有介导细胞间黏附和相互作用的功能, 而且主要以受体和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞质蛋白CRLF3是否也具有介导细胞间黏附和相互作用的功能, 或在细胞质中发挥通讯分子的作用,有待进一步探讨。

　　本研究中, 我们利用可诱导表达的大肠杆菌表达系统, 以原核表达质粒pGEX4T1为载体表达出GSTCRLF3的融合蛋白, 进一步应用GST亲和层析法有效分离得到纯化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6], 为下一步制备抗CRLF3的多克隆抗体, 更好的研究CRLF3的功能创造条件。

　　【参考文献】

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　　[6] 李 妍, 宁云山, 龙 敏, 等. 幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、 表达及其抗原性鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(4): 440-442.