抗CMTM4多克隆抗体的制备、 纯化和鉴定

　作者：李婷, 郭晓欢, 王 彧, Markus Plate, 邵陆宁, 宋泉声, 马大龙, 韩文玲* 作者单位：北京大学人类疾病基因研究中心 北京大学基础医学院免疫学系, 北京100083

　　【摘要】 　　目的: 制备抗CMTM4的多肽抗体并鉴定其性能。方法: 通过TMHMM、 DNAStar等软件对CMTM4的3种剪接体, CMTM4v1, v2和v3的蛋白序列进行分析, 选取了4段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联。其中第1、 2、 3条多肽为3种剪接体共有, 混合后免疫家兔, 制备Ab1; 而第4条多肽为CMTM4v1所特有, 单独免疫家兔, 制备Ab2。ELISA法检测抗体效价。免疫亲和层析法纯化后, 进行Western blot和免疫组织化学检测, 鉴定这2种抗体的特异性与适用范围。结果: 得到兔抗人CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2, 效价分别达1∶105和1∶106。纯化后的Ab1用于Western blot可特异识别超表达的CMTM4v1和v2, 并可用于免疫组织化学实验; 而Ab2仅可用于Western blot, 特异性识别超表达的CMTM4v1。Ab1还可特异识别小鼠内源性Cmtm4。结论: 用多肽免疫家兔制备的2种抗CMTM4抗体不仅具有较高的效价以及特异性, 并且Ab1还可以特异识别小鼠Cmtm4, 为CMTM4的功能研究提供了有力的支持。

　　【关键词】 CMTM4 多肽抗体 免疫亲和纯化

　　Preparation, purification and characterization of the polyclonal antibody against human CMTM4

　　LI Ting, GUO Xiaohuan, WANG Yu, Markus Plate, SHAO Luning, SONG Quansheng, MA Dalong, HAN Wenling*

　　Center for Human Disease Genomics, Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Peking University, Beijing 100083, China

　　[Abstract] AIM: To prepare, purify and characterize the polyclonal antibodies against CMTM4. METHODS: Four polypeptides named peptide 1, 2, 3, and 4 were synthesized based on the bioinformatics analysis of the three isoforms of CMTM4, CMTM4v1, v2, and v3, and coupled with keyhole limpet hemocyanin (KLH) for immunization. Among them, peptide 1, 2, and 3, common for CMTM4v1, v2, and v3, were mixed for immunization to prepare the antibody which can recognize all of the three isoforms (Ab1); while peptide 4, which is specific for CMTM4v1, was injected separately into New Zealand rabbits to prepare the antibody specifically targeting CMTM4v1 (Ab2). ELISA assay was used to detect the titers of the antibodies. After purification by immunoaffinity chromatography, Ab1 and Ab2 were identified by Western blot and immunohistochemistry assays. RESULTS: The titers of Ab1 and Ab2 were 1∶105 and 1∶106, respectively. Western blot confirmed their high specificity. Ab1 could also be used for immunohistochemistry analysis, but Ab2 could not. Immunohistochemistry analysis with Ab1 demonstrated the high expression level of CMTM4 in human testis, which was consistent with the previous result of Northern blot. Moreover, Western blot and immunohistochemistry analysis verified that Ab1 can also recognize mouse Cmtm4. CONCLUSION: Two specific antibodies against human CMTM4 were obtained, which will be helpful for further study.

　　[Keywords]CMTM4; Antipeptide antibody; Immunoaffinity chromatography purification

　　趋化素样因子(chemokinelike factor, CKLF)和趋化素样因子超家族成员18(chemokinelike factor superfamily member 18, CKLFSF18)是本研究室在国际上首次报道的一个新基因家族, 其编码产物的结构和功能特点介于经典的趋化因子与4次跨膜蛋白之间[1, 2]。由于该家族大部分成员存在不同剪接体, 且每个基因至少有一种剪接体的编码产物具有MARVEL结构域, 因此, 2005年12月, CKLFSF18被国际人类基因命名委员会(HUGO)重新命名为CMTM18(CKLFlike MARVEL transmembrane domain containing member 18)。

　　CMTM4有3种剪接体, CMTM4v1、 v2和v3, 分别编码234、 208和179个氨基酸; 其中CMTM4v1和v2是主要形式, 在多种组织中广泛表达; 而CMTM4v3仅存在于部分肾脏组织和胎盘组织中。CMTM4v2是该基因全长cDNA产物; 目前, 在小鼠中仅发现了Cmtm4v2(简称小鼠Cmtm4), 其氨基酸序列与人CMTM4v2同源性高达95.7%。CMTM4v1蛋白羧基端比v2多26个氨基酸。为了进一步研究CMTM4的生物学功能, 我们设计了CMTM4多肽, 免疫家兔, 制备多肽抗体; 通过免疫亲和层析方法, 对其进行纯化; 利用Western blot和免疫组织化学等实验鉴定其特异性与适用范围。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 新西兰家兔与C57BL/6N小鼠购自北京大学医学部动物中心。溴化氰(CNBr)活化的Sepharose 4B和硝酸纤维素膜(NC)购自Amersham Pharmacia biotech公司; 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司; IRDyetTM偶联的二抗购自LICOR BIOSCIENCE公司。弗氏佐剂购自Sigma公司。正常羊血清工作液、 真核细胞表达载体pcDNA3.1/MycHisB()购自Invitrogen公司; 真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB()CMTM4v2为本实验室构建。

　　1.2 方法

　　1.2.1 生物信息学分析及CMTM4多肽的设计 利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/)软件分析CMTM4蛋白跨膜区; 利用DNAstar软件包(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)进行多序列比对以及CMTM4的抗原性、 亲疏水性及表面暴露性预测[3]。综合考虑上述因素以及CMTM4的3种剪接体的序列特点, 选取CMTM4蛋白中4段氨基酸序列(命名为peptide1、 2、 3、 4。其中1、 2、 3为3种剪接体共有; 4为CMTM4v1特有), 在蛋白质数据库中验证其特异性后, 委托杭州中肽公司进行多肽合成以及KLH偶联。

　　1.2.2 CMTM4多肽抗体的制备 将与KLH偶联的peptide1、 2、 3等质量混合后免疫家兔, 制备可以识别全部3种剪接体的多肽抗体(Ab1); 偶联KLH的peptide 4单独免疫家兔, 制备特异针对CMTM4v1的抗体(Ab2)。初次免疫将300 μg的peptide 1、 2、 3混合多肽以及100 μg的peptide 4分别用PBS稀释至1 mL后与等体积的完全弗氏佐剂充分混合, 于两足蹠部各0.25 mL皮下注射, 其余后背部皮下多点(6点)注射。之后每2周加强免疫1次, 使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合后, 全部后背部皮下多点(8点)注射[4]。第2次加强免疫后14 d取兔耳缘静脉血样检测效价, 至效价达1∶105以上后, 将家兔处死, 心脏取血获取血清。

　　1.2.3 CMTM4多肽抗体效价测定 将CMTM4裸肽稀释至1 mg/L包被ELISA酶标板, 100 μL/孔, 10 g/L BSA 37℃封闭2 h。PBST(PBS+0.5 mL/L Tween20)洗涤3次后, 加入不同稀释度(1∶104, 1∶105, 1∶5×105, 1∶106)的免疫前后兔血清, 100 μL/孔, 37℃孵育2 h。彻底洗涤后加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5000), 37℃孵育1 h后洗涤, 加入TMB底物室温避光显色15 min, 加入2 mol/L H2SO4终止反应, 使用酶标仪测定A490值, 高于免疫前血清10倍为阳性。

　　1.2.4 CMTM4多肽抗体亲和纯化 首先将peptide 1、 2和3裸肽各3 mg的混合物以及peptide 4裸肽4 mg分别与CNBr活化的Sepharose 4B偶联, 制备多肽亲和层析柱。PBS冲洗并平衡柱料后, 分别加入PBS稀释的相应的免疫后血清4℃旋转孵育过夜。PBS冲洗柱料后使用pH2.4、 0.1 mol/L甘氨酸缓冲液洗脱。收集洗脱液, 立即用1/20体积的1 mol/L TrisHCl (pH9.0)中和并透析至PBS中。BCA法定量, SDSPAGE电泳鉴定抗体纯度。

　　1.2.5 CMTM4多肽抗体特异性和适用范围的鉴定 (1)Western blot检测: 用电穿孔法将真核细胞表达质粒pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1、 pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v2以及空载体对照pcDNA3.1/MycHisB(-)分别转染至HeLa细胞(2 mm电转杯, 120 v, 20 ms)。48 h后用RIPA裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH7.5, 150 mmol/L NaCl, 1 mL/L NP40, 5 g/L脱氧胆酸钠, 1 g/L SDS)裂解细胞。将细胞裂解物与SDS蛋白上样缓冲液混合煮沸10 min, 离心取上清进行125 g/L SDSPAGE电泳。湿式法电转至NC膜上。50 g/L脱脂奶粉(TBST配制)室温封闭1 h, 分别加入纯化后的CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2(1∶200, 封闭液稀释), 于4℃过夜反应; TBST(TBS+1 mL/L Tween20)洗涤3次后, 加入IRDyetTM800标记的抗兔二抗, 室温作用1 h; 彻底洗涤后, 用LICOR红外成像系统 (Odyssey, Lincoln, NE)检测信号。(2)CMTM4在人睾丸组织中表达情况的检测: 人睾丸组织取材后多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋切片。切片经过脱蜡, 梯度酒精水化, 30 mL/L H2O2室温避光孵育10 min去除内源性过氧化物酶, 在柠檬酸钠缓冲液中煮沸进行抗原修复, 正常羊血清工作液室温封闭10 min, 然后分别滴加CMTM4多肽抗体Ab1(1∶50, PBS稀释)和Ab2(1∶10), 4℃过夜反应。同样浓度的正常兔IgG作为阴性对照。PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔二抗室温反应30 min, PBS洗涤3次, DAB显色, 苏木精复染, 梯度酒精脱水, 最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。(3)免疫组织化学检测超表达的CMTM4: 将pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1和pcDNA3.1/MycHisB(-)空载体分别电转HeLa细胞, 48 h后胰酶消化细胞, PBS洗涤细胞2次后进行甩片, 每点3×104～10×104细胞, 经丙酮固定后, 进行免疫组化实验。经PBS洗涤, 去除内源性过氧化物酶, 和正常羊血清工作液封闭后, 按照上述免疫组化的方法依次与一抗、 二抗进行孵育, 并显色及观察结果。

　　1.2.6 CMTM4多肽抗体对小鼠内源性Cmtm4蛋白的识别 取C57BL/6N小鼠睾丸组织, 常规方法提取总蛋白及制作石蜡切片, 分别通过Western blot和免疫组化, 检测CMTM4多肽抗体Ab1对于小鼠内源性Cmtm4的线性表位和构象表位的识别情况。

　　2 结果

　　2.1 CMTM4的生物信息学分析 首先比较CMTM4v1、 v2和v3的氨基酸序列, 并分析其蛋白质序列和结构特征。人CMTM4v2是全长cDNA的编码产物, 编码208个氨基酸; 经过不同种属氨基酸序列的比对, 发现其在进化过程中非常保守, 在低等生物(例如: 鸡等)以及高等生物(小鼠、 大鼠)中均可发现其同源物, 且保守性很高, 小鼠与人的同源性为95.7%。CMTM4v1编码234个氨基酸, 羧基端比v2多26个氨基酸。同CMTM家族的其他成员一样, 生物信息学分析显示CMTM4v1和v2均含有MARVEL结构域和潜在的4次跨膜结构(图1)。利用DNAStar软件对CMTM4v1蛋白质的一级结构进行进一步分析, 综合考虑疏水性、 抗原性和表面暴露性等因素(图2), 选取了表1所示的序列合成4条多肽用以制备抗体, 分别命名为peptide 1、 2、 3、 4。其中peptide 1、 2、 3为CMTM4v1和v2所共有, 并且在人与小鼠仅差一个氨基酸; 而peptide 4为CMTM4v1特有。

　　图1 人CMTM4v1跨膜区分析(略)

　　Fig 1 Putative transmembrane regions analysis of human CMTM4v1

　　图2 人CMTM4v1亲水性、 抗原性和表面暴露性分析(略)

　　Fig 2 Bioinformatics analysis of human CMTM4v1 on its hydrophilicity, antigenic index, and surface probability

　　表1 用于CMTM4抗体制备的4条多肽序列(略)

　　Tab 1 Peptides used for the preparation of the antiCMTM4 polyclonal antibodies

　　2.2 多肽抗体的制备和效价 Peptide 1、 2、 3、 4的合成及KLH偶联由杭州中肽公司完成, 纯度分别为81.3%、 82.6%、 84.3%和96.1%。免疫3次后取兔耳缘静脉血样, ELISA检测抗体效价, 二者分别达到1∶105和1∶106。处死家兔获取血清后对其进行免疫亲和纯化。SDSPAGE电泳显示抗体纯度较高(结果未显示)。

　　2.3 Western blot检测多肽抗体的特异性 在HeLa细胞中超表达CMTM4v1和v2, 将细胞裂解液通过SDSPAGE电泳分离后转移至NC膜上, 分别用Ab1和Ab2进行检测。结果显示Ab1能够特异性识别超表达的CMTM4v1和v2蛋白; 而Ab2仅能识别CMTM4v1, 不能检测到CMTM4v2(图3)。

　　图3 Western blot鉴定CMTM4多肽抗体特异性(略)

　　Fig 3 The specificity of the antiCMTM4 polyclonal antibodies Ab1 and Ab2 verified by Western blot

　　A: Ab1 group; B: Ab2 group. 1: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-); 2: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1; 3: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v2.

　　2.4 免疫组织化学检测CMTM4在男性生殖系统中的表达 由于生物信息学分析以及之前的研究结果都提示CMTM4在男性生殖系统高表达, 于是使用Ab1和Ab2通过免疫组织化学的方法检测了CMTM4在正常人睾丸组织中的表达情况。如图4所示, Ab1可以在正常人睾丸组织中检测到CMTM4有较高的表达, 与之前Northern blot的结果一致[1], 并且在生精细胞中有明显的核定位; 但Ab2则无法检测到阳性信号。这提示Ab2不能用于免疫组化研究。

　　图4 免疫组织化学检测CMTM4在正常人睾丸组织中的表达(略)

　　Fig 4 The expression of CMTM4 detected by immunohistochemistry (×400)

　　A: Normal rabbit IgG control; B: Ab1 group; C: Ab2 group.

　　2.5 多肽抗体识别抗原构象表位的能力 免疫组化检测表明, Ab1能特异识别HeLa细胞中超表达的CMTM4v1蛋白, 但Ab2不能识别(图5)。这进一步证实Ab1能够识别抗原构象表位, 可应用于免疫组织化学研究; 而Ab2不适用。

　　2.6 CMTM4多肽抗体Ab1对小鼠Cmtm4的识别 由于制备抗体Ab1所使用人CMTM4的3条多肽与小鼠Cmtm4仅相差1个氨基酸, 所以理论上Ab1也可识别小鼠Cmtm4。Western blot显示, Ab1在小鼠睾丸组织蛋白中可检测到两条特异的带, Mr分别为72000和40000(图6A)。免疫组织化学实验也表明(图6B), 该抗体同样可以特异地识别天然构象的小鼠Cmtm4。

　　图5 免疫组织化学鉴定CMTM4多肽抗体识别抗原构象表位的能力(略)

　　Fig 5 The competence of the antiCMTM4 antibodies Ab1 and Ab2 to recognize the conformational epitopes verified by the immunocytochemistry assay (×400)

　　A, B: Ab1 group; C, D: Ab2 group. A, C: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-); B, D: HeLa cells transfected with pcDNA3.1/MycHisB(-)CMTM4v1.

　　图6 CMTM4多肽抗体Ab1可识别小鼠Cmtm4(略)

　　Fig 6 AntiCMTM4 antibody Ab1 can recognize mouse Cmtm4 (×400)

　　A: Western blot. 1: Normal rabbit IgG control; 2: Ab1 group. B: Immunohistochemistry. 1: Normal rabbit IgG control; 2: Ab1 group.

　　3 讨论

　　由于蛋白质空间结构的复杂性, 为了提高抗体对靶蛋白的识别效率和特异性, 我们采取了将多条多肽混合免疫家兔的方法。为了增加小分子多肽的免疫原性, 我们设计多肽时在其C端加一个半胱氨酸(多肽序列中已有半胱氨酸的除外), 用于与载体蛋白KLH偶联。此外, 一般认为, 多肽设计的长度应为10～20个氨基酸, 过短会使产生的抗体亲和力低下, 而过长则会导致合成纯化困难。但本研究中所设计的peptide2和3均达到甚至超过了30个氨基酸, 实践证明, 仍可获得纯度较高的多肽进而制备出高质量的抗体。

　　抗体的效价、 与抗原结合的特异性以及亲和力是判断其质量的标准。通过ELISA、 Western blot和免疫组织化学实验, 我们发现CMTM4多肽抗体Ab1和Ab2都具有较高的效价, 并且都能够特异识别相应靶蛋白的线性表位。此外, Ab1还能够识别天然构象的内源性蛋白, 用于免疫组化实验, 为进一步研究CMTM4的组织表达谱和细胞内定位提供了有效的手段; Ab2虽不能用于免疫组化的检测, 但其用于Western blot可以特异识别CMTM4v1, 这对研究CMTM4不同剪切体蛋白质的功能有很大的帮助。二者对于蛋白构象表位识别能力的差异, 也体现了制备抗体时用多条多肽混合免疫的优越性。另外由于小鼠Cmtm4与人CMTM4同源性极高, 所设计多肽区仅有一个氨基酸不同, Western blot和免疫组化实验证实, Ab1也能够识别小鼠Cmtm4。小鼠Cmtm4的预期Mr为23000, 但Western blot结果提示小鼠Cmtm4在睾丸组织中有2种形式, Mr分别为72000和40000左右。由于人CMTM4v2和小鼠Cmtm4均具有亮氨酸拉链结构, 而具有亮氨酸拉链结构的分子通常以二聚体或多聚体形式存在[5]。因此, Mr 72000和40000可能是Cmtm4的多聚体或二聚体形式, 也可能存在其他形式的修饰。

　　总之, 通过设计合成多肽来快速制备抗体为新基因功能研究提供了很好的方法。按照此方法, 我们成功地获得了CMTM家族所有成员的多肽抗体, 为该家族基因的功能和机制研究提供了一定的实验基础。

　　【参考文献】

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　　[2] Han WL, Lou YX, Tang JM, et al. Molecular cloning and characterization of chemokinelike factor 1 (CKLF1), a novel human cytokine with unique structure and potential chemotactic activity[J]. Biochem J, 2001, 357: 127-135.

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