可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白对小鼠淋巴细胞活化、 增殖和周期的影响

作者：邢飞跃, 于哲, 刘静, 季煜华 作者单位：暨南大学组织移植与免疫研究中心, 暨南大学医学院, 广东 广州 510632

　　【摘要】 　　目的: 研究可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白在小鼠淋巴细胞活化、 增殖和周期中的作用。方法: 选择有效剂量为500 μg/L Jagged 1/Fc嵌合蛋白(Jagged 1/Fc), 以活体染料/羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色, 建立在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)或佛波醇酯(PDB)加离子霉素(Ion)刺激下评价淋巴细胞增殖的模型, 通过流式细胞术分析Jagged 1/Fc对淋巴细胞增殖的作用; 采用碘化丙锭染色检测Jagged 1/Fc对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期变化的影响; 利用荧光标记的mAb双染技术观察Jagged 1/Fc对T细胞早期和中期活化标志CD69和CD25表达的影响。结果: Jagged 1/Fc对ConA刺激或非刺激的CD3+细胞CD69和CD25的表达无明显影响, 对ConA或PDB加Ion刺激或非刺激的淋巴细胞的增殖指数也无明显影响, 导致非刺激的淋巴细胞subG0期细胞百分比增高, S期细胞百分比降低, 但并不影响PDB加Ion诱导的淋巴细胞各期的变化。结论: 这些结果提示500 μg/L Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞活化和增殖无明显作用, 对PDB加Ion刺激的淋巴细胞周期也无明显影响, 但能促进未受刺激的淋巴细胞凋亡, 使细胞停滞于G0/G1期, 阻止其进入S期。

　　【关键词】 Jagged 1 淋巴细胞 活化 增殖 细胞周期

　　Effect of a soluble Jagged 1/Fc chimera protein on the activation, proliferation and cell cycle of lymphocytes in mice

　　XING Feiyue, YU Zhe, LIU Jing, JI Yuhua

　　Institute of Tissue Transplantation and Immunology, Department of Stomatology, Jinan University, Guangzhou 510632, China

　　[Abstract] AIM: To investigate effect of a soluble Jagged 1/Fc chimera protein (Jagged 1/Fc) on activation, proliferation and cell cycles of lymphocytes in BALB/c mice. METHODS: A model to evaluate the lymphocyte proliferation stimulated with a polyclonal activator, concanavalin A (ConA), was established by a carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester (CFDASE)labeling technique. Under an effective dose of 500 μg/L of Jagged 1/Fc, the effect of it on the lymphocyte proliferation was analyzed by flow cytometry. A propidium iodidelabeling technique was applied to estimate the influence of Jagged 1/Fc on the lymphocyte cellcycle stimulated by phorbol 12,13dibutyrate (PDB) plus Ionomycin (Ion). Expression levels of CD69 and CD25 molecules on surface of CD3+ lymphocytes activated with ConA in the presence of Jagged 1/Fc were observed by a fluoresceinconjugated monoclonal antibodylabeling technique. RESULTS: Jagged 1/Fc had no effect on the expression levels of CD69 and CD25 of the CD3+ lymphocytes stimulated with or without ConA, and no effect on the proliferation index of the lymphocytes stimulated by ConA or PDB plus Ion. It led to the increase of subG0 phase cell proportion and the decrease of S phase cell proportion of the lymphocytes, but did not influence the changes of the lymphocyte cellcycle induced by PDB plus Ion. CONCLUSION: The results suggest that Jagged 1/Fc has no obvious effect on the activation and proliferation of lymphocytes in mice, but may promote the apoptosis of them, cause the G0/G1 phase arrest and block the S phase entry.

　　[Keywords]Jagged 1; lymphocyte; activation; proliferation; cell cycle

　　Jagged 1是存在于哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一, 为单次跨膜糖蛋白, 表达于骨髓、 胎儿肝基质和胸腺上皮等多种细胞, 参与调控许多组织的生长发育, 维持正常造血干细胞的更新和分化。Jagged 1在T细胞、 抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)表面表达丰富, 介导树突状细胞(dendritic cells, DC)的成熟和分化[1]。近来发现, Jagged 1与相应的Notch受体结合, 激活Jagged 1Notch信号通路, 能够诱导外周T淋巴细胞向2型辅助T细胞(helper T cell 2, Th2)[2]和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)[3-5]分化, 可能在诱导免疫耐受中发挥重要作用。我们直接利用IgG Fc段融合的Jagged 1胞外结构域, 即可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白, 探讨其对小鼠淋巴细胞活化、 增殖和周期的作用, 将有助于进一步认识Jagged 1Notch信号通路对外周淋巴细胞生物学行为的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性SPF级BALB/c小鼠, 8周龄, 质量(20.3±2.0) g, 购自广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白A(ConA)、 二丁基佛波醇酯(phorbol 12,13dibutyrate, PDB)、离子霉素(ionomycin, Ion)和碘化丙锭(propidium iodide)购自Sigma公司; 羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester, CFDASE)购自Molecular Probes公司; 可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白(Jagged 1/Fc chimera protein, Jagged 1/Fc)为R&D Systems产品; antiCD3PE、 antiCD69FITC和antiCD25FITC购自eBioscience公司; RPMI1640和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为GibcoBRL产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 淋巴结细胞悬液的制备 脱颈断髓处死BALB/c小鼠, 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结, 去除被膜, 轻柔机械研磨, 于200目不锈钢网筛过滤, 收集细胞, 用冷PBS离心(300 g, 5 min)洗涤2次, RPMI1640完全培养基(含100 mL/L FBS, 下同)重悬细胞, 调整细胞密度至2×109/L。

　　1.2.2 荧光抗体染色分析CD69和CD25的表达 取2×109/L淋巴结细胞接种于24孔培养板, 每孔1 mL。设PBS对照组、 Jagged 1/Fc组、 ConA组和Jagged 1/Fc+ConA组, Jagged 1/Fc和ConA的终浓度分别为500 μg/L和5 mg/L。置37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养6 h, 离心(300 g, 5 min)收集细胞, 加入antiCD3PE和antiCD69FITC各0.5 μg, 混匀后4℃下避光放置30 min。PBS离心(300 g, 5 min)洗涤细胞2次, 在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上检测和分析。另取淋巴结细胞悬液, 分组如上, 同样条件下培养24 h, 离心收集细胞, 加入0.5 μg antiCD3PE和0.25 μg antiCD25FITC, 余后处理同前。

　　1.2.3 CFDASE染色检测淋巴细胞增殖 DMSO溶解CFDASE, 配成10 mmol/L储存液, 置-20℃保存, 临用前取其适量用PBS稀释成2 μmol/L的工作液, 平衡至室温。用PBS调淋巴结细胞的密度至2×1010/L, 加入等体积CFDASE工作液, 终浓度为1 μmol/L, 充分混匀, 在室温下避光轻轻振荡10 min, 然后用PBS离心(300 g, 5 min)洗涤细胞2次, 重悬于完全培养基中, 并调整细胞密度为2×109/L。将细胞种于96孔培养板中, 每孔200 μL, 设Jagged 1/Fc组、 Jagged 1/Fc+ConA组、 ConA组、 Jagged 1/Fc+PDB+Ion组、 PDB+Ion组及PBS对照组。分别加入终浓度为500 μg/L Jagged 1/Fc、 5 mg/L ConA、 1×10-7 mol/L PDB和0.5 mg/L Ion, 置37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养48 h或72 h, 收获细胞, 用FCM检测和分析, 通过ModFitLT V3.0(pMac)软件按以下公式自动拟合显示各组细胞的增殖指数(proliferation index, PI): PI=增殖后细胞总数/增殖前细胞总数。

　　1.2.4 碘化丙锭染色检测淋巴细胞周期 取淋巴结细胞悬液接种于96孔培养板上, 设Jagged 1/Fc组、 Jagged 1/Fc+PDB+Ion组、 PDB+Ion组及PBS对照组。分别加入Jagged 1/Fc和PDB+Ion(浓度同前), 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育48 h, 收集细胞, PBS离心(300 g, 5 min)洗涤细胞1次, 700 mL/L乙醇固定30 min, PBS离心(300 g, 5 min)洗涤细胞2次, 碘化丙锭溶液染色15 min, 然后用FCM检测各组细胞DNA含量。

　　1.2.5 FCM检测 在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R1, 然后对淋巴细胞CFDASE、 碘化丙锭、 FITC和PE荧光强度进行检测。其中, CFDASE和FITC为荧光1(FL1), 碘化丙锭和PE为荧光2(FL2)。每管样品检测10000个细胞, 所获数据用CellQuest软件分析。

　　1.2.6 统计学处理 实验数据以x±s表示, 多组间比较采用OnewayANOVA分析, 两组间比较用t检验, P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Jagged 1/Fc对淋巴细胞活化的影响 在静息状态下, 小鼠淋巴细胞低表达CD69和CD25, 分别为10.24%和2.5%。ConA刺激6 h和24 h后, 淋巴细胞表面CD69和CD25表达明显增高, 分别达30.19%和35.55%。在500 μg/L Jagged 1/Fc存在下, 处于静息状态或ConA刺激的淋巴细胞的CD69和CD25并无统计学意义(P>0.05)。这些提示Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞早期和中期活化无明显影响(图1A、 B)。

　　图1 可溶性Jagged 1/Fc对CD3+淋巴细胞CD69和CD25表达的影响(略)

　　Fig 1 Influence of soluble Jagged 1/Fc on CD69 and CD25 molecule expressions of mouse CD3+ lymphocytes

　　A: Effect of soluble Jagged 1/Fc on CD69 molecule expression of CD3+ lymphocytes stimulated with or without ConA; B: Effect of soluble Jagged 1/Fc on CD25 molecule expression of CD3+ lymphocytes stimulated with or without ConA.

　　2.2 Jagged 1/Fc对淋巴细胞增殖的影响 小鼠淋巴细胞培养48 h, 对照组仅见1个亲代峰, 无增殖峰; PDB+Ion组亲代细胞CFDASE荧光强度逐渐减弱, 呈现2个明显的子代峰, 子代细胞每分裂一代荧光强度减半(图2A)。淋巴细胞培养72 h, 对照组细胞稍有增殖, 出现1个亲代峰和2个很小的子代峰; ConA组细胞明显增殖, 出现4个子代峰; 在500 μg/L Jagged 1/Fc存在下, ConA刺激或非刺激的淋巴细胞增殖峰并无明显变化(图2B)。 ModFit 软件拟合显示, Jagged 1/Fc存在时, 淋巴细胞PI值也无统计学意义。以上提示500 μg/L Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞增殖无明显作用。

　　图2 可溶性Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞增殖的影响(略)

　　Fig 2 Influence of soluble Jagged 1/Fc on the proliferation of mouse lymphocytes

　　A: Effect of soluble Jagged 1/Fc on the lymphocyte proliferation stimulated with or without PDB plus Ion for 48 h; B: Effect of soluble Jagged 1/Fc on the lymphocyte proliferation stimulated with or without ConA for 72 h.

　　2.3 Jagged 1/Fc对PDB+Ion诱导下淋巴细胞周期的影响 PDB+Ion刺激48 h后, 淋巴细胞subG0期和G0/G1期荧光强度明显减弱, S期和G2/M期荧光强度增强; 加入Jagged 1/Fc后, PDB+Ion诱导的淋巴细胞各期荧光强度无明显变化, 而非诱导的淋巴细胞subG0期荧光强度增高, S期荧光强度减弱(图3A)。加入Jagged 1/Fc后, PDB+Ion诱导的淋巴细胞各期细胞所占百分比无明显改变, 而非诱导的淋巴细胞subG0期细胞所占百分比增高, S期细胞所占百分比降低(图3B)。这些提示, Jagged 1/Fc对PDB+Ion刺激的淋巴细胞周期无明显影响, 但能促进未受刺激的淋巴细胞凋亡, 使细胞停滞于G0/G1期, 抑制其进入S期。

　　图3 可溶性Jagged 1/Fc对小鼠淋巴细胞细胞周期的影响(略)

　　Fig 3 Influence of soluble Jagged 1/Fc on the mouse lymphocyte cell cycle

　　A: Effect of soluble Jagged 1/Fc on the lymphocyte cell cycle induced with or without PDB plus Ion for 48 h; B: Changes of the lymphocyte cell proportion induced with or without PDB plus Ion in the presence of soluble Jagged 1/Fc. aP<0.05, bP<0.01 vs control group.

　　3 讨论

　　在哺乳动物, Notch配体包括Delta 1、 Delta 3、 Delta4和Jagged1、 Jagged2两类。单独敲除Jagged1、 Jagged 2或Delta 1、 Delta 3和Delta 4的小鼠呈现不同的表型, 提示这两类配体具有非重叠作用。Delta和Jagged在骨髓和胸腺中均有表达, 它们对造血干细胞和胸腺细胞的更新和分化的影响仍存有争议: 有文献表明Jagged 1介导的Notch信号通路对于造血干细胞的自我更新和分化无关[6], 也有报道Delta 1能完全抑制人造血祖细胞向B细胞系分化, 促进T细胞和NK前体细胞表型的形成, 而Jagged 1并不影响T细胞、 B细胞和NK细胞的发育[7]。居多的研究结果支持Delta 1、 Delta 4和Jagged 2能抑制造血干细胞或造血祖细胞向B细胞系分化, 其中, Delta 1和Delta 4诱导其向T细胞分化, Jagged 2诱导其向NK细胞分化, Jagged 1则对其分化无明显影响。Delta 1和Jagged 1均能抑制胸腺细胞向B细胞分化, Delta 1诱导其向T细胞分化, Jagged 1则诱导其向NK细胞分化[8-10]。可见, 不同Notch配体在中枢免疫系统的淋巴细胞分化中起着不同作用。

　　在外周免疫系统, T细胞和APC表面丰富表达Jagged 1和Delta 1, 它们激活的Notch信号是否介导外周淋巴细胞分化呢? 很诱人的发现是: Delta 1可以诱导外周T细胞向Th1和CD8+调节性T细胞(CD8+ regulatory T cells, CD8+ Tr)分化, 而Jagged 1可能与Th2、 1型调节性T细胞(regulatory T cell 1, Tr1)和Th3分化有关[2-4]。另有研究证明Delta主要涉及T细胞、 B细胞去向和外周T细胞的成熟, Jagged 1则与γδ淋巴细胞和NK细胞的发育以及外周T细胞的分化有关[11]。不同Notch配体介导不同的Notch信号, 决定着外周淋巴细胞生成和分化的不同命运。Jagged 1与Delta 1对Th和Tr分化的不同影响, 可能为诱导Th 和Tr不同亚群细胞定向分化提供新的药物靶点。纵览文献注意到这些研究多采用含有Jagged 1基因全长或胞外段的表达载体转染细胞或与固有高表达Jagged 1的细胞共培养的手段, 而利用可溶性Notch配体研究Notch信号通路活化对外周淋巴细胞生物学行为的影响的报道甚少。Rutz等发现Delta 1/IgG和Jagged 1/IgG重组融合蛋白能抑制抗CD3刺激CD4+T细胞的早期和中期活化标志CD69和CD25的表达, 抑制CD4+T细胞的增殖, 呈剂量依赖关系; 同时, 转录因子NFAT、 AP1和 NFκB的活化也被抑制。Delta 4/IgG触发的Notch信号促进T细胞活化和增殖。可是Jagged 1/IgG并不影响PMA(phorbol 12myristate 13acetate)和离子霉素诱导的CD4+T细胞表面CD69的表达。Notch配体对初始T细胞分化的调节依赖于Notch信号介导TCR信号的强弱变化, 而不是仅仅依靠γ分泌酶介导的Notch胞内段释放的经典Notch信号转导[12]。本研究根据文献[13]和我们观察不同剂量Jagged 1/Fc嵌合蛋白诱导小鼠淋巴结细胞分化的结果(另文发表), 选择有效剂量为500 μg/L Jagged 1/Fc嵌合蛋白, 发现它不影响ConA刺激或非刺激的淋巴结CD3+细胞的早期和中期活化, 对ConA或PDB加Ion刺激或非刺激的淋巴细胞的增殖也无明显影响, 但能促进未受刺激的淋巴细胞凋亡, 使细胞停滞于G0/G1期, 阻止其进入S期。关于Jagged 1对外周淋巴细胞增殖和活化的报道不一, 可供参考的文献极其有限。Eagar等报道Jagged 1抑制T细胞活化、 增殖和细胞因子的生成, 而其他两个研究组发现阻断Notch信号通路可抑制T细胞增殖和CD25的表达, 结构性活化的Notch 1的表达能增加T细胞活化[12]。究其原因, 我们认为可能与不同Notch配体激发的Notch信号不同有关, 与不同来源淋巴细胞的前体细胞有关, 与Jagged 1的固定和非固定形式有关, 也与刺激剂不同有关, 后者也说明Jagged 1Notch信号可能与其他信号通路关联, 从而发挥调节T细胞的作用。此外, 直接利用可溶性Jagged 1蛋白探讨其作用和机制有利于剂量的严格控制和其生理、 药理及毒理效应的准确评价, 就其临床开发应用而言更具有可操作性。

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