抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

作者：王婉, 杨金菊, 刘莉, 陈志成, 高媛, 高建恩, 安立国, 孙启鸿* 作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫学研究室, 北京 100850; 北京蛋白质组研究中心抗体工程研究室, 北京 102206, 山东师范大学生命科学学院, 山东 济南 250014

　　【摘要】 　　目的: 制备抗人11β羟类固醇脱氢酶1(homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1)的单克隆抗体(mAb)并初步鉴定其特性。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定, 通过免疫沉淀、 UniZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果: 通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系。其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), Western blot 结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35000的蛋白; 应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库(UniZAP XR)进行筛选, 阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1。结论: mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1, 该mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化和免疫沉淀实验, 为HSD11B1的研究提供了有力的工具。

　　【关键词】 HSD11B1 单克隆抗体 线粒体

　　Generation and characterization of monoclonal antibody against HSD11B1

　　WANG Wan, YANG Jinju, LIU Li, CHEN Zhicheng, GAO Yuan, GAO Jianen, AN Liguo, SUN Qihong*

　　Department of Immunology, Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850; Department of Antibody Engineering, Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206; College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China

　　[Abstract] AIM: To generate and identify monoclonal antibodies (mAb) against homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1 (HSD11B1). METHODS: Normal human liver tissues were homogenized, and mitochondria were isolated by differential centrifugation. The total mitochondrial proteins were used to immunize BALB/c mice to generate mAb by hybridoma technique. The mAb were characterized by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. The antibody specificity was identified by immunoprecipitation (IP), and confirmed by UniZAP expression library screening. RESULTS: One hybridoma CBF245 secreting specific mAb against HSD11B1 was established. The Ig subclass of this mAb was IgG1, and it could be used in ELISA, Western blot, immunohistochemistry. Our data showed that the antigen recognized by CBF245 mAb was localized in the hepatocyte cytoplasm, with molecular weight of Mr 35 000 in the mitochondria of human liver tissue. The CBF245 mAb was further confirmed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. CONCLUSION: A hybridoma cell line stably secreting specific mAb against HSD11B1 is established and characterized. This mAb reacted with HSD11B1 in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay, IP, and would be very useful for the HSD11B1 studies.

　　[Keywords]HSD11B1; mAb; mitochondria

　　11β羟类固醇脱氢酶1(homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1, HSD11B1)属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族(SDR), 为相对分子质量(Mr)为34000的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存在于微粒体, 其作用依赖于辅酶NADP, 在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换, 调节局部糖皮质激素浓度, 并决定糖皮质激素流向其受体[1]。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加, HSD11B1调节异常, 可能是肥胖、 糖耐量低减、 高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一, 选择性HSD11B1抑制剂有望成为其治疗靶点。HSD11B1在体内广泛表达, 多分布于肝、 肺、 脂肪组织、 脉管系统、 卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb, 其中1株为鼠抗人HSD11B1 mAb, 并对其特异性进行了鉴定, 为进一步研究HSD11B1的作用奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂为Sigma公司产品; 羊抗鼠IgGHRP为中山公司产品; 蛋白酶抑制剂为Roche公司产品; BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品; cDNA 表达文库为美国Stratagene公司产品; PVDF膜、 ECL反应试剂盒均为Amersham公司产品; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700～750 r/min, 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min, 取上清, 10000 g离心10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗2次[2]。用RIPA裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE鉴定抗原的Mr。

　　1.2.2 鼠抗人mAb的制备 首次免疫免将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次, 1周后经尾静脉取血, 分离血清, ELISA法包被线粒体总蛋白10 μg/L测定效价。融合前3 d进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备mAb。

　　1.2.3 抗体识别抗原的鉴定 (1)免疫沉淀: 应用CBF245 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原, 进一步还原SDSPAGE电泳, 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入1∶2000稀释的mAb, 室温下孵育2 h(或4℃过夜), TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体(1∶5000稀释), 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。(2)抗原的UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中, 37℃震荡培养至A600为0.7左右, 3000 r/min下离心10 min, 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5, 取适当稀释的文库60 μL(含约50000个噬菌体)与600 μL重悬的XL1BLUE MRF’混匀后37℃温育20 min, 铺至150 mm的NZYLB平板上, 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面, 37℃继续培养3.5 h, 用防水墨水定位后, 剥离滤膜, 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆, 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。

　　1.2.4 mAb的鉴定 (1)Western blot分析: 线粒体总蛋白经还原SDSPAGE后, 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入1∶2000稀释的mAb, 室温下孵育2 h(或4℃过夜), TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体(1∶5000稀释), 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL, 室温孵育15 min, 滴加30 mL/L H2O2-甲醇, 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min, 加入1∶100稀释的鼠抗人HSD11B1 mAb, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。

　　2 结果

　　2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体, 每克肝组织可得到8～10 mg线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度, 多次结果显示为线粒体富集度为4～7倍, 成人肝组织线粒体总蛋白经还原SDSPAGE, 显示其Mr主要分布在25000～75000之间(图1), 与文献报道一致[3], 可作为免疫动物的抗原。

　　2.2 鼠抗人mAb的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化, 获得1株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株CBF245, 其亚类(型)为IgG1(κ)。

　　2.3 抗体识别抗原的鉴定 (1)抗原的免疫沉淀鉴定(图2): 泳道1用正常鼠血清免疫沉淀线粒体作为阴性对照, 泳道2为CBF245免疫沉淀线粒体的结果。Western blot和IP结果显示, CBF245特异识别成人肝线粒体组织中Mr为35000的蛋白(箭头所示), 泳道1和2中鼠mAb重链亦可见显色。(2)抗原的UniZAP XR人肝脏cDAN表达文库筛选: 用CBF245的杂交瘤细胞培养上清对UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库进行第1轮筛选, 铺板密度为50000个噬菌体/150 mm平板, 以保证在一张NC膜上尽可能多的增加免疫筛选的噬菌斑数, 经过第1轮筛选, 共得到了5个强阳性噬菌斑(图3A), 挖取此5个阳性噬菌斑混合后进行第2轮筛选, 铺板密度为1000个噬菌体/150 mm平板, 以获得可以分离的独立克隆。经第2轮筛选后, 阳性噬菌体得到大大的富集, 得到了单克隆的阳性噬菌斑15个(图3B)。分离其中的5个独立的阳性克隆进行体内剪切并转入大肠杆菌中, 并进行诱导表达, 测序。测序结果进行Blast比对。结果显示5个克隆测序结果一致, 阳性克隆插入基因起始位置为HSD11B1的前导肽, 距起始密码子ATG 39 bp, 因此CBF245识别的抗原为HSD11B1。

　　图1 成人肝组织线粒体总蛋白SDSPAGE电泳(略)

　　Fig 1 SDSPAGE analysis of human liver mitochondrial total lysates

　　M1: Protein marker; 1: Mitochondrial total lysates.

　　图2 CBF245 mAb的Western blot分析(略)

　　Fig 2 Western blot analysis of CBF245 mAb

　　M2: Mitochondrial proteins immunoprecipitated by normal mouse IgG; 2: Mitochondrial proteins immunoprecipitated by CBF245 (Primary antibody: CBF245).

　　图3 抗体CBF245的UniZAP XR表达文库的筛选(略)

　　Fig 3 Antibody screening of fusion proteins expressed in lambda UniZAP XR human liver expression cDNA library

　　A: The first cycle of screening; B: The second cycle of screening.

　　2.4 抗体的特异性鉴定 (1)mAb的Western blot检测: 正常成人肝组织线粒体总蛋白作为抗原进行Western blot鉴定。泳道1以正常鼠血清为一抗, 作为实验的阴性对照, 泳道2以分泌抗人HSD11B1抗体的杂交瘤细胞株CBF245的细胞培养上清作为一抗。Western blot结果显示, CBF245能特异识别成人肝胞质总蛋白中Mr约为35000的蛋白(图4)。(2)mAb的免疫组化鉴定: 免疫组化结果显示, 鼠抗人HSD11B1 mAb识别的抗原定位于成人肝组织肝细胞胞质(图5)。

　　图4 CBF245 mAb的Western blot分析(略)

　　Fig 4 Western blot analysis of CBF245 mAb

　　1: Primary antibody; Normal mouse IgG; 2: Primary antibody; CBF245.

　　图5 HSD11B1 mAb的免疫组化鉴定(略)

　　Fig 5 ImmunohistochemistryidentificationformAbagainstHSD11B1

　　A: Negative control; B: Localization of HSD11B1 in human liver tissue.

　　3 讨论

　　代谢综合征是高血压、 血糖异常、 血脂紊乱和肥胖症等多种疾病在人体内集结的一种状态。HSD11B1能增强糖皮质激素的活性, 糖皮质激素通过使糖异生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)表达上调, 对抗胰岛素活性, 抑制胰岛β细胞的分泌[4]; 糖皮质激素亦能增加脂肪细胞内脂肪生成和脂质合成代谢, 研究发现, HSD11B1转基因小鼠显示内脏脂肪组织肥厚[5]; 此外, HSD11B1可以通过增加肝脏血管紧张素原的表达来影响血压, 进一步的研究显示在脂肪组织中过多表达的HSD11B1影响肾素血管紧张素醛固酮系统而导致血压增高。综上所述, HSD11B1参与了胰岛素抵抗、 肥胖、 2型糖尿病、 高血压在内的代谢综合征的病理生理环节, 为临床研究提供了可喜的前景, 可通过选择性抑制HSD11B1的活性, 降低肝脏内和脂肪组织的氢化可的松浓度, 减少肝糖异生, 提高组织对胰岛素的敏感性, 为糖尿病及代谢综合征的研究和治疗提供新的靶点[6]。

　　我们采用正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体总蛋白, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备得到了一株抗HSD11B1的杂交瘤细胞株CBF245, 此mAb可应用于ELISA、 免疫组化和免疫沉淀实验, 为将来筛选表达HSD11B1的细胞和(或)组织、 HSD11B1的组织及细胞定位、 寻找与HSD11B1相互作用的分子提供了有力的工具。

　　【参考文献】

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