syk真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MHCⅠ类分子表达的影响

作者：单保恩, 宋小天, 齐义新 作者单位：河北医科大学第四医院科研中心, 河北 石家庄 050011

　　【摘要】 　　目的: 构建非受体蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体, 转染人乳腺癌细胞, 使其在细胞中稳定表达, 以研究Syk对人乳腺癌细胞MHCⅠ 类分子表达的影响。方法: 以RTPCR法从人乳腺癌细胞株MDAMB468扩增出syk编码序列基因片段, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5HisTOPO中。对重组质粒进行酶切、 PCR及测序鉴定后, 以脂质体介导法转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDAMB231, 经G418筛选, 构建syk基因稳定表达的细胞株, 通过Western blot、 RTPCR和流式细胞术检测转染乳腺癌细胞Syk、 MHCⅠ 及ICAMⅠ 的表达。结果: 构建了hsyk真核表达载体pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk, 并在人乳腺癌细胞MDAMB231中获得稳定表达。表达Syk的MDAMB231细胞同时可以高表达MHCⅠ和ICAMⅠ。结论: 成功地构建了syk真核表达载体并在真核细胞中表达, 为进一步的肿瘤免疫研究奠定了实验基础。

　　【关键词】 Syk 真核表达 乳腺癌细胞 MHC Ⅰ

　　Construction of the eukaryotic expression vector of human syk and its effect on MHCⅠ expression of human breast cancer cells

　　SHAN Baoen, SONG Xiaotian, QI Yixin

　　Research Center, the Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China

　　[Abstract] AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human spleen tyrosine kinase (Syk) and study the effect of Syk on MHCⅠ expression of human breast cancer cells. METHODS: A CDS fragment of human syk was obtained by RTPCR from human breast cancer cells MDAMB468 and then the fragment was cloned into the expression vector pcDNA3.1D/V5HisTOPO. After restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing confirmation, the recombinant hsyk expression plasmid was transfected into human breast cancer cells MDAMB231 by using lipofectamine protocols. After G418 selection, the cells stably expressed Syk. The expression of Syk, MHCⅠ and ICAMⅠ in the transfected cells was detected by Western blot, RTPCR and flow cytometry (FCM). RESULTS: The eukaryotic expression plamid pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk was constructed and it was expressed in the human breast cancer cells MDAMB231. The MDAMB231/Syk cells highly expressed MHCⅠand ICAMⅠ. CONCLUSION: The successful construction of eukaryotic expression plamid pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk and its expression in eukaryotic cells will be useful for further study of tumor immunity.

　　[Keywords]Syk; eukaryotic expression; breast cancer cell; MHCⅠ

　　非受体型蛋白酪氨酸激酶Syk是一种B细胞信号转导中最重要的激酶, 与T细胞中的ZAP70属于同一个PTK家族, 在T细胞和B细胞的成熟和活化过程中起关键作用[1]。Syk不但是免疫调节因子, 在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。国内外研究已证实, Syk能够抑制乳腺肿瘤细胞的生长和转移, Syk表达的缺失/降低与正常乳腺组织向恶性发展有关[2], 但是Syk抑制肿瘤细胞侵袭性生长的具体机制尚不清楚。肿瘤的发生发展转移是多阶段、 多因素的复杂过程, 其中逃避免疫监视则是最为重要的环节之一[3]。因此, 分析与syk基因有关的抗肿瘤免疫活性, 探讨因Syk表达缺失而导致的肿瘤免疫逃逸作用及其机制具有十分重要的价值。本研究将syk基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5HisTOPO中, 在脂质体作用下将该载体转染MDAMB231细胞, 检测该细胞诱导的免疫学功能变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 逆转录酶AMV购自美国Promega公司; 高保真酶KOD Plus购自ToYoBo公司; 限制性内切酶ApaⅠ购自大连TaKaRa生物工程公司; TRIzol试剂、 真核表达载体pcDNA3.1D/V5HisTOPO和转染试剂盒PlusTM Reagent均购自美国Invitrogen公司; 琼脂糖回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Omega公司; 抗MHCⅠ和ICAMⅠ抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因的聚合酶链反应(PCR) 按TRIzol试剂盒说明书提取人乳腺癌细胞MDAMB468总RNA, 根据反转录和PCR试剂盒操作说明扩增syk cDNA。根据GenBank中登录的syk cDNA序列和pcDNA3.1D/V5HisTOPO载体设计引物, 上游引物序列为: 5′CACC ATG GCC AGC AGC GGC ATG GCT G3′, 下游引物序列为: 5′GTT CAC CAC GTC ATA GTA GTA ATT GCG3′。扩增产物用5 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.2 重组质粒的构建及鉴定 参考TOPO载体的使用说明, 在6 μL连接反应体系中依次加入如下各成分: Fresh hsyk PCR product 2 μL, Salt solution 1 μL, sterile water 2 μL, TOPO vector 1 μL, 轻轻混匀, 22～23℃水浴反应30 min, 置于冰浴中, 连接产物直接用于转化TOP10感受态细胞, 37℃震荡培养1 h, 涂于琼脂平板中过夜培养。挑选Amp阳性菌落, 经增殖培养后提取质粒, 分别进行PCR扩增、 ApaⅠ酶切鉴定。对两种实验结果均与预期结果相符的单克隆进行DNA序列测定(上海生物工程技术有限公司完成), 以保证重组质粒中插入syk基因片段正确性。

　　1.2.3 MDAMB231细胞的转染 MDAMB231细胞常规培养于含100 mL/L小牛血清的DMEM中, 于转染前24 h收集细胞并接种于24孔板中, 细胞密度为2×105/孔。置于37℃、 50 mL/L CO2孵箱培养24 h, 待每孔中细胞生长密度达70%～80%后, 按PlusTM Reagent说明书进行转染。转染同时设对照组: 以不含syk基因片段的pcDNA3.1质粒作为空载体转染对照组, 操作方法同重组质粒pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk。用G418筛选方法获得稳定表达Syk的细胞。

　　1.2.4 转基因表达产物的检测 提取细胞总RNA, RTPCR鉴定表达产物; 提取细胞蛋白质, 用Western blot检测蛋白质的表达。

　　1.2.5 流式细胞术(FCM)检测MHCⅠ和ICAMⅠ蛋白的表达 共检测3组细胞: syk转基因细胞(MDAMB231/Syk)、 转染空载体细胞(MDAMB231/pcDNA3.1)和未转染细胞(MDAMB231)。

　　1.2.6 RTPCR检测3组细胞MHCⅠ和ICAMⅠmRNA的表达 根据GenBank中登录的序列设计引物, MHCⅠ上游引物: 5′AGG GGC CGG AGT ATT GGG AC3′, 下游引物: 5′GCC AGG TCA GTG TGA TCT CCG C3′, 可以扩增出489 bp长片段。 ICAMⅠ上游引物: 5′GGC AAG AAC CTT ACC CTA CG3′, 下游引物: 5′GAG ACC TCT GGC TTC GTC AG3′, 可以扩增出589 bp长的片段。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.7 统计学处理 数据分析使用SPSS11.5统计软件。所有数据用x±s表示, 两组间均数比较用t检验, 多组间均数比较采用单因素方差分析, P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 目的基因syk的扩增 利用syk基因的特异引物, 进行RTPCR扩增, 获得1910 bp大小的片段, 与预期分子大小相符(图1)。

　　2.2 重组质粒的构建及鉴定 PCR扩增出syk基因; Apa Ⅰ酶切结果见图2, 经酶切和电泳后, 出现2条片段, 即1611 bp和5809 bp大小; DNA测序结果显示, 构建的质粒中插入的基因片段全长为1910 bp(包括引物5′端的CACC), 其编码序列与GenBank中登陆的syk基因的序列相符, 阅读框保持不变。

　　图1 syk基因RTPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(略)

　　Fig 1 Agarose gel electrophoresis of syk RTPCR product

　　M: DL 10000 DNA marker; 1: syk RTPCR product.

　　图2 重组质粒pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk的酶切鉴定(略)

　　Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk

　　M: DL 10000 DNA marker; 1: Recombinant plasmid pcDNA3.1D/V5HisTOPO/hsyk; 2: Recombinant plasmid digested by Apa Ⅰ.

　　2.3 转基因表达产物的检测 转基因细胞MDAMB231的mRNA及蛋白质经RTPCR和Western blot分析表明, syk基因成功转入MDAMB231细胞中(图3、 4)。

　　图3 syk mRNA表达的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳(略)

　　Fig 3 Agarose gel electrophoresis of syk mRNA RTPCR product

　　1: MDAMB231/Syk; 2: Positive control; 3: MDAMB231 cells; M: DL 10000 DNA marker.

　　图4 Syk蛋白表达的Western blot分析(略)

　　Fig 4 Expression of Syk protein analysed with Western blot

　　1: MDAMB231 cells; 2: Positive control; 3: MDAMB231/Syk cells.

　　2.4 不同MDAMB231细胞MHCⅠ和ICAMⅠ蛋白表达的变化 FCM结果显示, 转染syk基因的细胞比未转染细胞及转染空载体细胞表达MHCⅠ和ICAMⅠ的蛋白水平明显增高(表1)。

　　表1 MHCⅠ和ICAMⅠ蛋白的表达(略)

　　Tab 1 Expression of MHCⅠand ICAMⅠin these cells

　　aP<0.05 vs MDAMB231/pcDNA3.1 cells group and MDAMB231 cells group.

　　2.5 不同MDAMB231细胞MHCⅠ和ICAMⅠ mRNA的表达 RTPCR结果显示, 转染syk基因的细胞比未转染细胞及转染空载体细胞表达MHCⅠ和ICAMⅠ的mRNA水平明显增高(图5)。

　　图5 MHCⅠ和ICAMⅠ mRNA表达的RTPCR检测(略)

　　Fig 5 Detection of MHCⅠ and ICAMⅠ mRNA expression in these cells by RTPCR

　　M: DL 1000 DNA marker; 1-3: MHCⅠexpression in MDAMB231/Syk cells, MDAMB231/pcDNA3.1 cells, MDAMB231 cells; 4-6: ICAMⅠ expression in MDAMB231/Syk cells, MDAMB231/pcDNA3.1 cells, MDAMB231 cells.

　　3 讨论

　　免疫监视学说是20世纪50年代后期由Thomas和Burnet提出的, 自此, 肿瘤免疫一直是肿瘤学和免疫学研究者致力研究的重要内容。机体存在多种免疫监视机制, 发挥着抗肿瘤作用, 包括特异性和非特异性、 细胞免疫和体液免疫等, 而以T细胞、 NK细胞和巨噬细胞为主的细胞免疫发挥着更为重要的作用。尽管如此, 肿瘤仍然能在体内发生并持续发展, 其直接原因就是肿瘤具有逃避免疫监视的功能。乳腺癌细胞逃避免疫监视的机制主要涉及以下几个方面: ①肿瘤细胞自发分泌抑制性细胞因子, 如TGFβ、 IL10、 VEGF等, 促进免疫应答的因子分泌减少, 如IL2等; ②肿瘤细胞MHC分子表达异常, 如Ⅰ类分子减少或缺失, 导致其提呈内源性抗原肽能力下降, 使肿瘤细胞不能被杀伤性T细胞所识别; ③肿瘤细胞通过表达FasL与T细胞表面Fas结合, 诱导T细胞凋亡, 下调免疫功能; ④肿瘤细胞抗原表达减少或缺失, 致使免疫细胞不能被充分活化, 从而停滞于克隆无能或免疫忽视状态; 此外, 肿瘤细胞黏附分子表达缺失也可以通过影响肿瘤细胞淋巴细胞间的作用强度, 导致其逃避机体的免疫监视[4, 5]。

　　近年来, Syk作为一种免疫相关分子, 与乳腺癌的相关性研究越来越多。大量研究证实, Syk可以抑制乳腺癌细胞的生长和转移, 但Syk参与肿瘤免疫的相关机制研究未见报道。为此, 本实验构建了Syk的真核表达载体, 转染Syk表达缺失的人乳腺癌细胞, 使其在细胞中稳定表达, 检测了转染细胞及未转染细胞MHCⅠ和ICAMⅠ的表达等情况。实验结果显示, 转染syk基因的乳腺癌细胞比未转染细胞表达MHCⅠ和ICAMⅠ的水平明显增高, 提示Syk的表达有可能提高肿瘤细胞对自身抗原的提呈能力, 促进肿瘤细胞与免疫细胞间的相互作用, 从而可以更好地激活机体的免疫细胞, 增强对肿瘤细胞的识别和清除能力。

　　本实验在载体构建中采用了拓扑克隆法[6], 其核心是拓扑异构酶Ⅰ, 它能够在特殊的位点结合双链DNA, 切割一条链5′CCCTT后的磷酸二酯键, 断裂的磷酸二酯键释放的能量以共价键的形式储存在断裂的3′磷酸末端和拓扑异构酶Ⅰ的酪氨酸274之间, 之后, DNA和酶之间的磷酸酪氨酸键被原始切断的链的5′OH攻击, 逆转反应并释放拓扑异构酶Ⅰ。在此系统中, 载体5′末端悬挂4个碱基GTGG, 在上游引物加CACC使PCR产物5′末端加CACC, 这样可以保证克隆的正确方向性, 正确率大于等于90%。

　　【参考文献】

　　[1] Stewart ZA, Pietenpol JA. Syk: a new player in the field of breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2001, 3(1): 5-7.

　　[2] Coopman PJP, Domt H, Barth M, et al. The Syk tyrosine kinase suppresses malignant growth of human breast cancer cells[J]. Nature, 2000, 406(6797): 742-747.

　　[3] Tuener M, Schweighoffer E, Colucei F, et al. Tyrosine kinase Syk, essential functions for immunoreceptor signaling[J]. Immunol Today, 2000, 21(3): 148-154.

　　[4] Antonia SJ, Extermann M, Flavell RA. Immunologic nonresponsiveness to tumors[J]. Crit Rev Oncol, 1998, 9(1): 35.

　　[5] Melero I, Bach N, Chen LP. Costimulation, tolerance and ignorance of cytolytic T lymphocytes in immune responses[J]. Life Science, 1997, 60(23): 2035.

　　[6] 冯 洁, 李 宁, 吕 枚. 甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及其真核表达载体的构建[J]. 武警医学院学报, 20