KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

作者：张晓静, 葛银林*, 侯琳, 李泉 作者单位：青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室, 山东 青岛 266021

　　【摘要】 　　目的: 采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达, 探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。方法: 采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF7, 诱导RNAi, 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法, RTPCR, Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化。采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤, 监测肿瘤生长变化, RTPCR, 免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化。结果: 靶向KDR基因siRNA转染MCF7后, 细胞增殖被抑制, KDR mRNA和蛋白的表达明显降低; 裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制; RTPCR, 免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调。各对照组指标无明显变化。结论: 化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF7细胞增殖, 是潜在的肿瘤治疗新方法, 而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。

　　【关键词】 RNA干扰 siRNA MCF 7细胞 血管内皮生长因子受体2 基因治疗

　　Small interference RNAs directed against KDR gene inhibit the proliferation of breast cancer cells in vitro and in vivo

　　ZHANG Xiaojing, GE Yinlin*, HOU Lin, LI Quan

　　Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021, China

　　[Abstract] AIM: To inhibit kinase insert domaincontaining receptor (KDR) expression chemically modified siRNA in vitro and in vivo and to investigate the feasibility and specificity of gene therapy for breast cancer. METHODS: In vitro, siRNA was transfected into MCF7 cells to induce RNAi by using cationic liposome Lipofectamine2000TM. The changes of KDR mRNA and protein expression in both siRNA treatment group and control group were measured by MTT assay and RTPCR, In vivo, the siRNA was transfected into transplanted tumor in nude mice by using cationic polymer nanoparticle In vivo jetPEITM. Tumor growth was observed. The mRNA and protein expression of KDR was measured by RTPCR and immunohistochemical staining. RESULTS: Experiments in vitro showed that siRNA directed against KDR effectively inhibited the proliferation of MCF7 cells and downregulated KDR mRNA expression. In vivo, the growth of tumor was visibly suppressed. Furthermore, RTPCR and immunohistochemical results indicated that KDR mRNA and protein expression was reduced in excised tumors. CONCLUSION: RNAi mediated by chemically modified siRNA markedly decreased KDR gene expression and inhibited cellular proliferation. It may have the potential as a therapeutic method to treat human cancer.

　　[Keywords]RNAi; siRNA; MCF7; VEGFR2; gene therapy

　　恶性肿瘤生长过程中, 肿瘤组织内细胞急剧、 持续性增殖的病理生理学基础是肿瘤组织内血管的再生。有研究认为, 含激酶插入区受体(kinase insert domaincontaining receptor, KDR), 即血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)在血管内皮和部分肿瘤细胞, 包括乳腺癌细胞上特异性表达, 对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用, 在肿瘤发生、 发展中起重要的调节作用[1] 。肿瘤细胞分泌VEGF, 除了以旁分泌的形式作用于血管内皮上的KDR, 促进血管形成外, 还以自分泌的方式作用于自身细胞上的KDR, 直接促进肿瘤细胞生长[2, 3]。所以, 抑制KDR 的表达, 可以在两个水平上抑制肿瘤生长。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一项新兴的基因治疗技术[4], 是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。siRNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效应分子。我们依据RNAi原理, 设计合成以KDR为靶的siRNA, 并对其进行化学修饰, 增强其在体内外的稳定性, 并以人类乳腺癌细胞株MCF7为研究对象, 在体外细胞水平及裸鼠动物水平, 探讨siRNA对KDR基因特异性沉默及对细胞和瘤体增殖的抑制作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 乳腺癌MCF7细胞株购自中国协和基础学院细胞中心, 常规培养于含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM(Gibco公司产品)培养液中, 50 mL/L CO2、 37℃饱和湿度的孵箱中培养传代。BALB/c nu/nu裸小鼠(雌性, 4周龄, 体质量12～14 g), 购自上海斯莱克动物有限公司, 按规定饲养于无菌动物试验室, 经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。LipofectamineTM2000及TRIzol为Invitrogen公司产品; In vivo jetPEITM为Poly Plus公司产品; AMV 逆转录试剂盒购自Promega公司; 鼠抗flk1多克隆抗体(sc6251)为santa cruz公司产品; 免疫组化检测试剂盒PV6002购自北京中杉公司; ECL发光试剂购自北京普利莱公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 siRNA设计合成 从美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人KDR mRNA的序列全长(GI: 11321596), 利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure 4.4, 将随机设计的siRNA与预测的mRNA二级结构对比, 选择出一条与预测的KDR mRNA容易结合的siRNA, 其KDR siRNA序列为: 5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′(正义链), 5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′(反义链); 阴性对照siRNASCR(scramble siRNA)序列为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′(正义链), 5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′(反义链)。两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同源性。为增强siRNA的稳定性, 对正义链进行氟代修饰, 反义链不修饰, 由上海吉玛化学修饰合成。

　　1.2.2 转染 根据Lipofectamine2000TM试剂操作指南, 采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的MCF7细胞, 调整细胞密度, 接种于12孔板, 用含100 mL/L血清不含抗生素的DMEM培养, 次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。siRNA与Lipofectamine2000TM分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释, 5 min内将其混合, 室温静置20 min后加入细胞孔中, 细胞置于培养箱常规培养, 6 h后荧光显微镜下观察。选用siRNA与Lipofectamine2000TM最佳转染比例。

　　1.2.3 MTT法测细胞增殖 收集对数生长期细胞接种于96孔板, 细胞汇合度达90%后, 设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基), 脂质体组(只加LipofectamineTM2000, 0.5 μL/孔), 4个siRNA浓度梯度组(25、 50、 100、 200 nmol/L), siRNASCR组(100 nmol/L), 每组6个平行孔, 每孔终体积100 μL, 按上述方法进行转染。置37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养48 h后加MTT(5 g/L) 20 μL/孔, 继续孵育4 h, 弃上清, 加DMSO 100 μL/孔, 振荡10 min, 使结晶充分溶解, 在酶联仪492 nm波长处测各孔的A值, 以公式(1-A/C)×100%计算siRNA对肿瘤细胞的生长抑制率(A, C分别为给药组细胞和对照组吸收度平均值), 数据进行统计学分析。

　　1.2.4 半定量 RTPCR 检测KDR mRNA的水平 收集转染24 h细胞, 按照TRIzol试剂盒操作说明提取细胞总RNA, 所提RNA溶于20 μL无酶水中, Eppendorf核酸定量测定仪测RNA浓度和纯度, 并行8 g/L琼脂糖凝胶电泳, 观察RNA完整性。将1 μg总RNA行20 μL体系逆转录反应, 取cDNA后续25 μL体系PCR反应, 并以无酶水作为阴性模板对照。PCR反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s; 64℃退火45 s; 72℃延伸2 min。35个循环后72℃延伸7 min。KDR上游引物: 5′CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA3′, 下游引物: 5′AATACCAGTGGATGTGATGCGG3′, 扩增产物795 bp; 内参照GAPDH上游引物: 5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′, 下游引物: 5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′, 扩增产物为509 bp。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶电泳上观察拍照, 并运用天能分析软件对条带进行光密度扫描, 检测各组KDR mRNA扩增产物与其对应的内参GAPDH mRNA扩增产物A值, 然后将AVEGF/AGAPDH的比值进行统计学分析。

　　1.2.5 裸鼠体内抑瘤试验 (1)动物模型的建立: 参照文献[5, 6]方法, 选4周龄BALB/c nu/nu裸鼠, 每周2次腹腔注射苯甲酸雌二醇10 mg/kg, 连续2周。取对数生长期的MCF7细胞经胰酶消化后, 用Hank液清洗2次, 在细胞记数板上作细胞记数, 并调节使活细胞密度为5×1010/L, 于裸鼠右侧腋窝偏背部接种0.1 mL/只(含细胞5×106个)。(2)分组及给药: 以瘤体直径≥5 mm为成瘤阳性, 将成瘤阳性的裸小鼠随机分为4组, 每组5只。进行瘤内给药。对照组: 仅注射50 g/L葡萄糖溶液; 脂质体处理组: 注射in vivo jetPEITM和50 g/L葡萄糖溶液; 小剂量KDR siRNA处理组: 注射KDR siRNA(0.5 mg/kg), in vivo jetPEITM和50 g/L葡萄糖溶液; 大剂量KDR siRNA处理组: 注射KDR siRNA(1 mg/kg), in vivo jetPEITM和50 g/L葡萄糖溶液。KDR siRNA与in vivo jetPEITM比例按操作说明进行, 终体积均为100 μL。每3 d注射1次, 连续8次。裸鼠按规定饲养于无菌动物试验室, 按公式V=0.5 a×b2 (V代表瘤体积, a为长径, b为短径) 每3 d测量瘤体积, 绘制瘤体增长曲线。22 d后拉颈处死裸鼠, 分离得瘤体, 部分瘤组织加入液氮匀浆提取RNA。部分入100 mL/L中性福尔马林中固定, 依次进行系列梯度脱水、 浸蜡、 包埋及切片(厚度4 μm)后, 按常规进行HE染色, 免疫组化染色按试剂盒说明采用两步法, 标本微波修复, 一抗flk1浓度为1∶300, 于光镜下观察结果。

　　1.2.6 统计学处理 数据用x±s表示, 经SPSS12.0统计软件分析, 多组间差异显著性检验用单因素方差分析, 两组间比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 KDR siRNA的设计 根据人KDR mRNA的序列, 利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure 4.4, 将随机设计的siRNA与预测的mRNA二级结构对比, 选择出一条与预测的KDR mRNA容易结合的siRNA, 其KDR siRNA序列为: 5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′(正义链), 5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′(反义链)。

　　2.2 MTT比色法检测siRNA对肿瘤细胞生长抑制作用 转染KDR siRNA 48 h后, MCF7细胞增长明显减慢, MTT数据统计处理结果显示: KDR siRNA 4个浓度组A值与脂质体组比较有统计学意义(P<0.01); 错义序列组(即siRNASCR组)与脂质体组比较差异不大(P>0.05)。100 nmol/L组和200 nmol/L组比较无统计学意义。这表明: KDR siRNA对细胞增殖的抑制作用, 在一定范围内抑制率随着浓度增加而增加, 达到一定浓度后, 再增加siRNA浓度并不提高沉默作用。各组A值及抑制率数值(表1)。

　　表1 MTT比色法检测MCF7转染siRNA 48 h后增殖情况(略)

　　Tab 1 Detection of proliferation of MCF7 cells 48 h after siRNA transfection by MTT colorimetry

　　bP<0.01 vs blank control group.

　　2.3RTPCR检测KDR mRNA表达的变化与未转染组比较, 脂质体组与错义序列组无统计学意义; KDR siRNA 50nmol/L、 100nmol/L和200nmol/L 3组数据均有统计学意义(P<0.05), 50 nmol/L与100 nmol/L和200 nmol/L组相比有统计学意义(P<0.05), 而100 nmol/L和200 nmol/L这两组之间比较无统计学意义(图1), 结果表明, 达到一定浓度的KDR siRNA转染细胞24 h后明显下调了KDR mRNA的表达, 与MTT法检测结果相符。

　　图1 RTPCR检测转染siRNA 后MCF7细胞KDR mRNA表达水平(略)

　　Fig 1 Expression of KDR mRNA in MCF7 cells transfected with siRNA measured by RTPCR

　　Rnasefree water was used as negative PCR control; GAPDH was used as a control. M: DNA markers; 1: Rnasefree water; 2: 50 nmol/LKDR siRNA group; 3: 100 nmol/L KDR siRNA group; 4: 200 nmol/L KDR siRNA group; 5: Transfected with siRNASCR group; 6: Transfected with Lipofectamine group; 7: Nontransfected group.

　　2.4 裸鼠体内试验

　　2.4.1 裸鼠皮下移植瘤体积监测 用药21 d后, 全部裸鼠均存活。与对照组比较, 小剂量和大剂量KDR siRNA处理组移植瘤增长趋势均受抑(P<0.05), 大小剂量组相比亦有统计学意义(P<0.05), 转染试剂组与对照组相比无统计学意义(图2)。

　　2.4.2 半定量RTPCR 分析结果 与对照组比较, 大、 小剂量KDR siRNA治疗组明显下调了KDR mRNA的表达(P<0.05), 大、 小剂量治疗组相比差别也有统计学意义(P<0.05), 转染试剂组与对照组相比差别无统计学意义(图3)。

　　2.4.3 肿瘤组织形态学改变和KDR表达变化 HE染色见肿瘤细胞呈上皮性, 巢状排列, KDR siRNA治疗组(图4A)与对照组(图4B)相比, 可见大片细胞坏死, 说明肿瘤细胞增殖受到抑制, 生长不良。免疫组化染色显示KDR的阳性物质为棕黄色细颗粒, 主要定位于肿瘤细胞的细胞膜、 细胞质中, 其阳性细胞呈弥漫性或局灶性分布。KDR siRNA治疗组(图4C)相对于对照组(图4D), 染色阳性细胞明显减少。

　　图2 不同处理组用药后裸鼠皮下移植瘤平均体积增长趋势图(略)

　　Fig 2 The growth curves of tumors average volumes in different groups after treatment

　　A: Control group; B: Transfecting agent group; C: Small does treatment group; D: Big does treatment group. As shown in the figure, the growth of tumor in groups treated with small or big dose KDR siRNA is obviously suppressed. The growth of tumor in big dose group is more slowly than that in small dose group.

　　图3 不同处理组移植瘤RTPCR结果(略)

　　Fig 3 KDR mRNA expression in excised tumors of different groups

　　M: DNA marker; 1: 50 g/L glucose control group; 2: In vivo jetPEITM; 3: Small dose KDR siRNA; 4: Big dose KDR siRNA.

　　图4 不同处理组肿瘤组织HE及免疫组化染色(略)

　　Fig 4 HE and immunohistochemical staining of tumor tissues in different groups(original magnification, ×800)

　　A, C: Belong to the group treated with big dose KDR siRNA; B, D: Belong to the 50 g/L glucose control group. HE staining showed that there were large areas of cytoclasis in the center of tumors in the group treated with KDRsiRNAs(A) compared with the control group(B). IHC analysis showed that KDR immunoreactivity was widely expressed in the cell membrane and cytoplasm in the control group(D). In the contrast, in KDRsiRNA treatment group(C), the immunoreactivity is decreased significantly.

　　3 讨论

　　血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)在乳腺癌生长、 浸润及转移中发挥重要作用。已发现的VEGFR有3种: VEGFR1 (FLT1)、 VEGFR2(FLK1、 KDR)和FLT4, 但在细胞生长和分化中起重要作用而与血管生成有关的主要是FLK1(KDR)[7]。很多研究是将VEGF作为靶基因[8], 并且多是探讨其在血管生成中的作用, 对癌细胞自身作用探讨较少。近年新的研究表明, VEGFR2(KDR)在人类多种恶性肿瘤包括乳腺癌细胞均有较高水平表达, 并以自分泌作用于肿瘤细胞, 促进其生长[9]。本实验室前期研究也发现KDR在MCF7乳腺癌细胞上有表达, 因此我们选用MCF7作为研究对象, 探讨抑制KDR对肿瘤增长的影响。

　　小分子干扰RNA(siRNA)是RNAi的效应分子, 由两条互补RNA单链构成, 包括5′磷酸端、 19个核苷酸的双链区、 3′羟基端和2个不配对的3′端核苷酸突起, 可指导mRNA的裂解。但siRNA稳定性较差, 易被核酸酶降解, 因而在体内的应用受到了限制[10]。本实验中我们运用RNAi技术, 进行了两方面改进: (1)对siRNA进行化学修饰。在核糖2′位置引入某些取代基如氟后, 使siRNA具有更强的抵抗核酸酶的性能。细胞转染试验和小鼠体内试验发现2′F siRNA与2′OH siRNA的基因沉默效应无明显差别[11]。另外, siRNA反义链3′端的突起起识别与结合靶mRNA的作用, 该处的化学修饰明显降低了RNA干扰的程度, 而对正义链修饰较少影响siRNA活性。因此, 我们选择对正义链氟代修饰, 反义链不修饰的方法, 既增强siRNA体内抵抗核酸酶的能力, 又保证了作用的特异性。(2)运用合适的体内转导系统。我们采用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)作为siRNA导入载体, PEI是一种阳离子聚合物纳米粒, 较脂质体或病毒载体, 减少了细胞毒性, 也避免了病毒载体潜在的免疫原性和致瘤性问题。PEIsiRNA生物体内给药系统, 已经被很多研究证明是抑制特定基因表达的理想工具[12]。

　　体外实验以阳离子脂质体为转染试剂, 优化转染条件得到siRNA与Lipofectamine2000TM最佳质量体积比为10 pmol∶0.5 μL。MCF7细胞转染KDR siRNA后, MTT证实其对细胞增殖的抑制, 并从mRNA和蛋白水平均检测到siRNA对靶基因的沉默效果。体内实验, 我们运用PEI阳离子聚合物纳米粒, siRNA与In vivo jetPEITM最佳质量体积比为10 μg∶1.8 μL包裹siRNA, 以50 g/L葡萄糖溶液作为稀释液, 直接注射瘤体内。结果表明, KDR siRNA治疗组裸鼠生长状态良好, 肿瘤增长缓慢, 从瘤体提取mRNA和免疫组化染色, 分别从基因和蛋白水平检测到KDR基因表达的下调。

　　综上所述, 本研究结果表明: 对KDR siRNA进行有效化学修饰, 并运用合适的转导系统导入细胞及裸鼠体内, 能够有效降低KDR基因的表达, 抑制肿瘤细胞的增殖。可作为肿瘤基因治疗的新途径, 而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。

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