HER2/neu和GMCSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究

作者：唐三元*, 黄卫国, 伍尤华, 戴文香, 江青山 作者单位：南华大学: 附属第一医院肿瘤内科, 肿瘤研究所, 附属第一医院耳鼻喉科, 湖南 衡阳 421001

　　【摘要】 　　目的: 探讨HER2/neu蛋白细胞胞外段的基因重组腺相关病毒(rAAVHER2/neu)和粒巨噬细胞集落刺激因子重组腺相关病毒(rAAVGMCSF)共转染树突状细胞(DC)诱导的细胞免疫应答。方法: 成熟的DC通过淋巴细胞分离液分离培养获得, 流式细胞技术分析HER2/neu以及细胞表面标志CD1a、 CD83、 CD80、 CD86和HLADR的表达, MTT检测混合淋巴反应, 3HTdR释放法检测CTL杀伤活性, RTPCR检测FasL表达。结果: 共转染组(CT)、 单独转染组(ST)和未转染组(UT) 3组DC的细胞表面标志表达无统计学意义(P>0.05), 共转染组中HER2/neu和FasL的表达比单独转染组高, 共转染组中可以检测到更强的混合淋巴细胞反应和CTL杀伤活性。结论: HER2/neu蛋白细胞外段的基因通过DC的抗原提呈作用可以诱导出免疫应答, 其免疫应答作用与FasL表达相关, 而GMCSF可以增强其免疫应答作用。

　　【关键词】 HER2/neu 树突状细胞 GM CSF 免疫应答

　　树突状细胞(DC)是最强的抗原提呈细胞(APC), 能有效地刺激T细胞, 激发T细胞对抗原产生免疫应答。在体外研究中发现DC的抗原提呈能力是巨噬细胞的10～100倍。细胞因子的应用具有安全性和广泛性, 将编码细胞因子的基因导入DC, 可以提高DC的活性, 诱导更强烈的抗肿瘤免疫反应。粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)作为DC的一种重要的营养成分, 可以保证DC的存活, GMCSF最终能启动杀伤性T细胞抗肿瘤的免疫应答。本研究中将编码HER2/neu蛋白细胞外段的基因重组腺相关病毒(rAAV)转染DC, 借助DC强大的抗原提呈能力, 作为肿瘤疫苗打破免疫耐受, 激活T淋巴细胞的杀伤能力, 从而诱发机体对HER2/neu过表达细胞的免疫杀伤。同时将GMCSF作为免疫增强剂转染DC, 以增强DC的抗原提呈作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 乳腺癌细胞株SKBR3、 293细胞购自中南大学细胞室, rAAVHER2/neu, rAAVGMCSF由美国阿肯色大学医学院基因治疗中心惠赠。RTPCR试剂和RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司。抗Her2/neu、 CD1a、 CD83、 CD80、 CD86、 HLADR多抗及免疫组化试剂均购自Dako公司。淋巴细胞分离液购自中科院血液研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DC的分离和培养 取乳腺癌患者外周血50 mL用淋巴分离液分离获得单个核细胞, PBS洗涤2次, 用AIMV培养基制细胞悬液, 加入6孔培养板(1 mL/孔)中, 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养4～6 h, 轻轻洗出悬浮细胞(收集后作为T效应细胞), 在培养板中加入AIMV和GMCSF(终浓度为800 U/mL), 每孔3 mL。DC分为2组: 第1组加入rAAVHER2/neu, 10 μL/孔; 第2组加入293细胞冻融液。病毒作用8h后换液, 除上清后, 加入AIMV+ GMCSF 3mL/孔。第3天换液, 主要悬浮细胞回收, 加入AIMV+IL4+GMCSF+TNFα(终浓度200 U/mL), 促进DC成熟。第6、 7天大收集悬液, 同时用PBS冲洗培养板, 收集所有悬浮细胞为成熟DC。

　　1.2.2 rAAVHER2/neu和rAAVGMCSF转染 单独转染组: 2×105个293细胞重悬于0.7 mL的PBS并和含有10 μg的rAAVHER2/neu的0.3 mL PBS混合。通过96孔板法筛选转化的293细胞, 流式细胞术分析HER2/neu的表达。共转染组: 2×105个293细胞重悬于0.7 mL的PBS并和含有rAAVHER2/neu和rAAVGMCSF各10 μg的0.3 mL PBS混合。通过96孔板法筛选转化的293细胞, 流式细胞术分析HER2/neu的表达。

　　1.2.3 自体T效应细胞的扩增 将上述T细胞收集到培养瓶中, 加入RPMI1640+100 mL/L人AB血清+GMCSF(终浓度200 U/mL)+IL2(终浓度200 U/mL), 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱, 隔日半量换液、 传代。

　　1.2.4 DC表面标志及病毒转染后HER2/neu在DC的表达的检测 FITCCD1a、 PECD83、 FITCCD80、 FITCCD86、 PEHLADR两两组合放入一管中标记DC, FITCHER2/neu单独放入一管标记两组DC。细胞用PBS洗2次, 然后加入单克隆抗体(mAb)各10 μL, 4℃冰箱中避光反应30 min, 加入PBS 0.5 mL, 震荡悬浮细胞后上流式细胞仪分析目的蛋白和GMCSF的表达开始时间、 持续时间和表达高峰。

　　1.2.5 混合淋巴反应的检测 将培养第7天的单独转染组DC、 共转染组DC、 无病毒组DC用30 mg/L的丝裂霉素, 37℃作用30min用PBS洗3次。T细胞用含IL2(100U/mL)和100 mL/L的人AB型血清的RPMI1640稀释成3×109/L, 加入96孔培养板(1 mL/孔)按1∶5、 1∶10、 1∶20 效应细胞∶靶细胞(E∶T)分别加入上述3组DC, 同时设对照组(只加入RPMI1640培养液), 每组3复孔。37℃培养箱中孵育90 h后加5 g/L的MTT 10 μL/孔, 6 h后加入0.04 mol/L 盐酸酸化异丙醇100 μL/孔。在酶标仪上测570波长的A值。刺激指数(SI)=试验孔A平均值/对照孔A平均值。

　　1.2.6 特异性CTL细胞杀伤活性检测 采用同一个体CTL来源的外周血单核细胞经单独转染组、 共转染组的DC刺激, 进行CTL细胞毒性检测, 靶细胞为乳腺癌细胞株SKBR3。采用3HTdR释放法进行杀伤活性测定: 取1～2×109/L靶细胞分别加入3.7×105 Bq 3HTdR(比活性为0.37～1.30×109 Bq/mL), 置于37℃水浴2h, 充分洗涤, 细胞密度为2×108/L,96孔板中, 每孔加入1×105已标记的细胞, 然后每孔再加入5×105效应细胞, 每组设4个复孔。培养板经500 r/min离心30 s, 继续置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中18 h, 1500 r/min离心10 min, 每孔吸取150 μL上清, 补加等量的含有复合消化酶的Hanks’液, 震荡1 min, 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中30 min, 收集细胞于玻璃纤维滤纸上, 放入液闪微量杯中进行测量, 按下列公式计算释放率。杀伤率=[(1-实验组cpm)/对照组cpm]×100%。

　　1.2.7 CTL中FasL表达的检测 分别提取单独转染组和共转染组DC诱导的CTL 1×106个细胞, 提取总RNA通过RTPCR合成cDNA。再以cDNA, 用FasL的特异性引物进行PCR扩增: 94℃ 变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 共33个循环。引物序列由上海生工公司合成, 上游引物5′CAA GTC CAA CTC AAG GTC CAT GCC3′; 下游引物5′CAG AGA CTC AGA AC GTT GAC3′。PCR产物通过20 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.8 统计学处理 数据以x±s表示, 应用SPSS13.0统计学软件统计, 采用χ2或t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 DC的形态 外周血获取的单核细胞, 培养第2天可见细胞贴壁生长, 形成散在的集落, 第4天开始, 集落变大, 有少量悬浮细胞出现, 第6天大部分细胞悬浮, 直径在10～20 mm之间, 细胞表面可见许多不规则的刺状突起。

　　2.2 单独转染和共转染后HER2/neu在DC的表达及DC表面标志检测 共转染组中HER2/neu蛋白表达的量多, 并且持续时间长, 且有GMCSF的高表达。共转染组(CT)HER2/neu蛋白表达为87.1%, 而单独转染组(ST)检测到ER2/neu蛋白表达为80.4%, 两组具有统计学意义(P<0.05), 无转染组(UT)为35.1%。3组细胞均高表达CD80、 CD83、 CD86、 HLADR, 较低表达CD1a, 3组无统计学意义(表1)。

　　表1 三组DC表面标志的表达(略)

　　2.3 混合淋巴反应的检测 三组DC在不同的效应细胞∶靶细胞(E∶T)比例中均能刺激T淋巴细胞增殖, 共转染组DC刺激T淋巴细胞增殖能力(刺激指数SI)明显高于单独转染组(P<0.05), 且均高于无病毒转染组DC(P<0.05, 图1)。

　　图1 三组DC同种混合淋巴反应的检测 (略)

　　2.4 特异性CTL的检测 单独转染和共转染的DC 2次刺激后都能明显诱导出HER2/neu特异的CTL, 随着效靶比的升高, CTL的杀伤活性逐步升高, 共转染组诱导的CTL活性高单独转染组(P<0.05, 图2)。单独转染和共转染的DC分别于0、 7、 14 d刺激, 并在CTL诱导的第7、 14、 21天收集细胞检测CTL杀伤活性。结果显示, 外周血单核细胞经过转染DC的1次刺激即能诱导较强的针对HER2/neu特异的杀伤活性, 随刺激次数的增加, 杀伤活性逐渐增强(图3)。

　　图2共转染组和单独转染组诱导的CTL活性比较(E∶T=10∶1)(略)

　　图3 共转染组和单独转染组不同刺激次数下特异性CTL杀伤活性(略)

　　A: 共转染组; B: 单独转染组.

　　2.5 FasL表达的检测 单独转染组和共转染组DC刺激后所诱导的CTL均表达FasL, 20 g/L琼脂糖凝胶上FasL条带大小约350 bp, 共转染组表达高于单独转染组(P<0.05, 图4)。

　　图4 CTL中FasL表达的检测(略)

　　A: 1: DNA marker; 2: 无转染组; 3: 共转染组; 4: 单独转染组. B: 相对灰度值比较: 凝胶扫描后灰度值通过软件Band leader3.0定量分析.

　　3 讨论

　　HER2/neu原癌基因位于人类17号染色体上, 编码的蛋白是一个185 kD的单链跨膜糖蛋白, 即P185, 属于表皮生长因子受体(EGFR)家族[1]。HER2/neu在成人正常组织中极少表达, 但在多种人类肿瘤中存在过度表达, 如: 乳腺癌、 肾癌、 卵巢癌、 肺癌等[2, 3]。由于正常组织中极少表达HER2/neu蛋白, 自身反应性T细胞能够识别显性表位并产生免疫耐受, 体内天然的完整HER2/neu蛋白不能诱导出免疫反应。而用HER2/neu蛋白的非显性表位肽, 合成肽, 或计算机分析筛选的肽片段能够产生免疫反应。免疫组化染色发现乳腺癌细胞的HER2/neu蛋白水平比正常组织高10～100倍, 正常组织中低表达HER2/neu诱导的自身免疫耐受, 可被肿瘤细胞高表达的HER2/neu蛋白打破, 肿瘤患者体内存在针对HER2/neu蛋白的细胞和体液免疫, 说明机体可以打破对HER2/neu蛋白的自身耐受[4, 5]。

　　我们的实验结果中, rAAVHER2/neu单独转染组、 共转染组和无转染组细胞, 在培养第6天后均观察到了典型的DC形态, 均高表达CD80, CD83, CD86, HLADR, 较低表达CD1a, CD40, 无明显差异, 说明培养的DC成熟度均较高。3组DC在不同的E∶T细胞比例中刺激T淋巴细胞增殖能力依次为: 共转染组>单独转染组>无病毒转染组。

　　我们的研究将编码HER2/neu蛋白细胞外段的基因转染DC后, 无论是单独转染还是共转染, 均能明显诱导出HER2/neu特异的CTL, 随着效靶比的升高, CTL的杀伤活性逐步升高, 并且共转染组诱导的CTL活性高单独转染组。说明借助DC强大的抗原提呈能力, 以HER2/neu蛋白细胞外段的基因作为抗原致敏DC, 可以打破免疫耐受, 诱发机体对HER2/neu过表达细胞的免疫杀伤, 是一种可行的肿瘤免疫治疗方法。针对HER2/neu的肿瘤疫苗与mAb相比有其独特的优点, 作为主动免疫, 其杀伤能力是持续性的, 作用时间长, 同时, 由于免疫记忆的形成, 还可以执行免疫监视功能, 减少复发的可能, 由于是自身免疫应答, 在开发疫苗的过程中更有利于减少毒性的发生[6, 7]。

　　GMCSF作为DC的一种重要的营养成分, 可以保证DC的存活。GMCSF最终能启动杀伤性T细胞抗肿瘤的免疫应答, 同时, GMCSF作为一种免疫增强剂, 不会出现严重的安全性及自身免疫等问题[8, 9]。我们将rAAVHER2/neu和rAAVGMCSF同时转染DC, 观察到了HER2/neu和GMCSF获得双重表达, 并且GMCSF表达可以增强CTL杀伤活性、 增强FasL的表达, 说明GMCSF具有增强DC的抗原提呈作用激发免疫应答的能力。

　　CTL介导细胞毒性有主要是通过Fas配体(FasL)/Fas途径, 也称为CD95L/CD95途径。CTL细胞表面表达死亡诱导分子FasL与靶细胞上的Fas的相互作用后, 引起蛋白溶解酶的级联反应, 激活靶细胞的自杀途径, 最终导致靶细胞凋亡和溶解。本实验用rAAVHER2/neu单独转染和共转染DC所诱导的特异性CTL, 用FasL特异性引物经RTPCR均能扩增出特异性条带, 表明该CTL内有FasL mRNA的表达, 提示FasLFas可能是HER2/neu特异性CTL发挥杀伤效应的主要途径之一。

　　本研究中通过DC的抗原提呈功能结合GMCSF的免疫增强作用, 诱导出了针对HER2/neu蛋白的特异性CTL, 具有安全、 高效等特点, 具有良好的应用前景, 这种以DC为平台的主动免疫治疗技术结合细胞因子诱导的抗肿瘤免疫反应以及针对HER2/neu靶点的RNAi治疗[10], 将为乳腺癌和其他肿瘤的免疫治疗提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Zwick E, Wallasch C, Ullrich A. HER2/neu: a target for breast cancer therapy[J]. Breast Dis, 2000, 11: 7-18.

　　[2] Verri E, Guglielmini P, Puntoni M, et al. HER2/neu oncoprotein overexpression in epithelial ovarian cancer: evaluation of its prevalence and prognostic significance[J]. Oncology, 2005, 68(2-3): 154-161.

　　[3] Szelachowska J, Jelen M, Kornafel J. Prognostic significance of intracellular laminin and Her2/neu overexpression in nonsmall cell lung cancer[J]. Anticancer Res, 2006, 26(5B): 3871-3876.

　　[4] Ferretti G, Felici A, Papaldo P, et al. HER2/neu role in breast cancer: from a prognostic foe to a predictive friend[J]. Curr Opin Obstet Gynecol, 2007, 19(1): 56-62.

　　[5] Traina A, Agostara B, Marasa L, et al. HER2/neu expression in relation to clinicopathologic features of breast cancer patients[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1089: 159-167.

　　[6] Helguera G, Dela Cruz JS, Lowe C, et al. Vaccination with novel combinations of antiHER2/neu cytokines fusion proteins and soluble protein antigen elicits a protective immune response against HER2/neu expressing tumors[J]. Vaccine, 2006, 24(3): 304-316.

　　[7] Mittendorf EA, Storrer CE, Shriver CD, et al. Investigating the combination of trastuzumab and HER2/neu peptide vaccines for the treatment of breast cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2006, 13(8): 1085-1098.

　　[8] Chang CJ, Chen YH, Huang KW, et al. Combined GMCSF and IL12 gene therapy synergistically suppresses the growth of orthotopic liver tumors[J]. Hepatology, 2007, 45(3): 746-754.

　　[9] Hege KM, Jooss K, Pardoll D. GMCSF genemodifed cancer cell immunotherapies: of mice and men[J]. Int Rev Immunol, 2006, 25(5-6): 321-352.

　　[10] 程联胜, 查 昭, 席甲甲, 等. 腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(8): 691-695.