Clusterin抗原的表达、 抗体制备及其初步鉴定

作者：张迎春, 刘莹, 杨金菊, 柳晓兰, 迟俊, 高建恩, 唐晓波, 朱大岭, 孙启鸿* 作者单位：蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心抗体工程研究室, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫学研究室, 北京 100850; 哈尔滨医科大学药学院, 黑龙江 哈尔滨 150081

　　【摘要】 　　目的: 制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定。方法: 以成人肝cDNA 表达文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU。GSTCLU 融合蛋白在大肠杆菌中表达, 被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb。采用ELISA法和 Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性。采用Western blot, 间接免疫荧光, 免疫组化鉴定mAb的特异性。结果: GSTCLU 融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明, 制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52000和58000的CLU蛋白。获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU 蛋白, 其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白, 4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白。结论: 成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb, 为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础。

　　【关键词】 Clusterin 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体

　　Preparation and characterization of antibodies against clusterin

　　ZHANG Yingchun, LIU Ying, YANG Jinju, LIU Xiaolan, CHI Jun, GAO Jianen, TANG Xiaobo, ZHU Daling, SUN Qihong*

　　State Key Laboratory of Proteomics, Department of Antibody Engineering, Beijing Proteome Research Center, Beijing 100850; Division of Biopharmaceutics College of Pharmacy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

　　[Abstract] AIM: To prepare rabbit polyclonal antibodies (pAb) and mouse monoclonal antibodies (mAbs) against human clusterin(CLU) and characterize these antibodies’ properties. METHODS: CLU fragment was amplified from human liver cDNA library, and recombinant expression vectors pGEX4T1CLU and PET32aCLU were constructed. GSTCLU fusion protein was expressed in E.coli and then used as the immunogen. Properties of antiserum against human CLU were identified by ELISA, Western blot, and the mAbs against human CLU was characterized by Western blot, indirect immunofluorescent staining and immunohistochemistry staining. RESULTS: The GSTCLU fusion protein was highly expressed with a molecular weight of 54000. Western blot analysis proved that the rabbit pAb could specifically recognize 52000 and 58000 proteins in human liver total protein. All of the nine established mAbs recognized recombinant human CLU protein, two of which specifically bound to proteins in the cytoplasm of HepG2 cells and four of which specifically bound to proteins in the cytoplasm of adult liver tissue. CONCLUSION: pAb and mAbs against human CLU were successfully prepared, which will provide efficient tools for functional studies of CLU expressed in human tumors.

　　[Keywords]clusterin; prokaryotic expression; polyclonal antibody; monoclonal antibody

　　Clusterin(CLU)是一种普遍存在的异源二聚体硫酸化糖蛋白, 其基因定位于人类染色体8p21, 含449个氨基酸, 相对分子质量(Mr)为75000～80000。它主要存在于细胞质中并被分泌到细胞内环境, 由于CLU mRNA不同的剪切翻译, 形成sClusterin(sCLU)和nClusterin(nCLU) 2种变体, 分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用[1, 2], 因其功能多样化, 又名为 TRPM2, SGP2, XIP8, ApoJ (apolipoprotein J), SP 4040。在生理条件下, 主要参与脂质转运、 组织重建、 细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程[3]。在病理条件下, 近年来众多的研究结果表明, CLU 在肾细胞癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、 发展过程中起重要的癌基因作用[1, 4]。并且它的表达还受与肿瘤生长相关的多种细胞因子的调控, 如1,25二羟维生素 D3、 转化生长因子β1、 电离辐射等。但是目前, CLU基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手, 获得其融合表达蛋白后, 免疫家兔和BALB/c小鼠, 制备抗CLU抗血清和CLU的mAb, 并进行特性鉴定, 为进一步研究CLU的功能及其在肿瘤的发生、 发展及治疗中的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 成人肝cDNA表达文库购自Cloneteck公司。大肠杆菌BL21感受态菌株, pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶BamH I和Xhol I, ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒, 质粒提取试剂盒购自Omega Biotek公司。BALB/c小鼠和2.0～2.5 kg雄性大耳白兔子购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCult biotechnology b.v. 公司。鼠抗GST标签mAb, HRP羊抗鼠IgG, HRP羊抗兔IgG, FITC羊抗鼠 IgG, ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Poly Helper购自北京吉比埃生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CLU 抗原的制备和纯化 根据Human Protein Reference Database中提供的CLU的氨基酸序列, 并结合应用生物信息学软件DNAstar lasergene 7.1(DNA*公司)的表位分析, 综合设计引物。在其上游引物设计BamH I 酶切位点, 下游引物设计Xhol I 酶切位点, 片段全长750个碱基(201～449氨基酸), 以成人肝cDNA表达文库为模板进行PCR反应。回收扩增的目的片段并分别与经BamH I和Xhol I双酶切后的pGEX4T1和PET32a载体, 进行连接, 转化大肠杆菌, 阳性克隆经测序正确后抽提质粒, 进行诱导表达。CLU在BL21细菌中表达形式为包涵体, 表达后进行了复性和纯化。

　　1.2.2 GSTCLU融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF 膜上。封闭液封闭后, 加入鼠抗GST mAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗鼠 IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。

　　1.2.3 兔抗人CLU抗血清的制备 将纯化的CLU融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后, 每只家兔皮下多点注射融合蛋白 600 μg; 初次免疫4周后加强免疫1次, 接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血, 分离血清, 分装后置-20℃保存。

　　1.2.4 兔抗CLU血清的特性鉴定 (1)ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用HisCLU融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。按1∶4梯度稀释抗血清每孔加入 100 μL(阴性对照为正常兔血清代替兔抗CLU血清, 空白对照为TBST代替兔抗CLU血清), 37℃孵育30 min洗涤3次后, 加入1∶6000稀释的HRP羊抗兔 IgG, 37℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。(2)Western blot检测CLU融合蛋白: 将纯化后蛋白经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后, 并转膜, 依次加入兔抗人CLU血清及HRP羊抗兔 IgG, ECL显色后观察结果。(3)Western blot检测抗CLU抗血清: 将肝匀浆总蛋白以12 g/L的浓度上样, 经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后, 并转膜, 依次加入按1∶10000稀释的兔抗人CLU多克隆抗体及HRP羊抗兔 IgG, ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常兔血清代替抗CLU抗血清, 空白对照为TBST代替抗CLU抗血清[5]。

　　1.2.5 鼠mAb的制备 3只6～8周龄, 质量为17～21 g的BALB/c小鼠。将人GSTCLU融合蛋白80 μg溶于250 μL生理盐水并与等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化, 对BALB/c小鼠进行皮下和腹腔注射。首次免疫4周后进行第2次免疫, 免疫剂量减半, 并与等量弗氏不完全佐剂充分乳化。第2次免疫后7 d, 经尾静脉采血, 用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3 d 后, 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆化, 并按常规方法制备mAb 腹水[6]。

　　1.2.6 抗CLU mAb的特性鉴定 (1)mAb的腹水效价及Ig亚类的测定: 腹水中mAb的效价采用间接ELISA法测定。采用Hbt小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗CLU mAb的Ig亚类。(2)mAb的特异性鉴定: Western blot检测, 将纯化后GSTCLU和HisCLU融合蛋白加入还原性SDSPAGE上样缓冲液中, 于100℃变性10 min。取4 μL进行120 g/L SDSPAGE, 并转膜, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP羊抗鼠IgG, ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清, 阳性对照为融合鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清。间接免疫荧光检测, 将 HepG2细胞以1×108/L的浓度铺6孔板, 培养48 h后, 40 g/L多聚甲醛(10 g/L TRIton)固定10 min(PBS洗涤3次); 羊血清封闭(37℃, 30 min); 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清(4℃过夜, PBS洗涤3次); 滴加1∶200稀释的 FITC羊抗鼠 IgG(室温孵育30 min, PBS 洗3次); 加染核试剂 Hochest(室温孵育30 min, PBS 洗3次; 800 g/L甘油封片, 镜检拍照。免疫组化染色, 将成人肝脏组织石蜡切片, 常规脱蜡至水, 30 mL/L的H2O2封闭(室温30 min), 10 mmol /L的柠檬酸盐缓冲液中微波加热修复(92℃～98℃, 15 min), 羊血清封闭(37℃, 30 min), 依次加杂交瘤细胞培养上清(4℃孵育过夜, TBST洗涤3次)及Poly Helper(37℃孵育30 min, TBST洗涤3次), HRP羊抗鼠 IgG(同上孵育及洗涤后), 加DAB显色, 经苏木素复染、 脱水、 透明及封片后, 观察结果。

　　2 结果

　　2.1 GSTCLU 融合蛋白的表达与鉴定 SDSPAGE电泳检测, 观察到含重组质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU的菌经IPTG诱导后, 与大肠杆菌BL21 空菌对照相比在Mr约54000和47000处均出现1条新的蛋白带, 其大小与预测的CLU融合蛋白的Mr相一致, 表达量约占菌体总蛋白的50%～60%, 融合蛋白主要以包涵体的形式表达(图1A)。通过Western blot检测, 应用抗GST的抗体能够在相应位置检测到GST和GSTCLU融合蛋白(图1B)。

　　图1 CLU融合蛋白的SDSPAGE和Western blot分析(略)

　　Fig 1 SDSPAGE and Western blot analysis of CLU fusion protein

　　A: 1: Protein marker; 2: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 3: HisCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 4: Lysates of E.coli BL21. B: 1: Blank PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 2: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21.

　　2.2 兔抗CLU抗血清的特性鉴定 ELISA 检测板用HisCLU融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。间接法检测抗体的效价为1∶512000。用兔抗CLU抗血清对融合蛋白进行Western blot实验, 证实在Mr约54000和47000处各有一特异性的条带, 说明表达的CLU蛋白具有较好的免疫学活性。Western blot分析显示兔抗CLU 多抗可以在肝匀浆总蛋白中检测到Mr为52000和58000的蛋白条带, 这与Human Protein Reference Database中报道的CLU 2个变体的Mr一致。阳性对照(pGEX4T1载体在大肠杆菌中表达后的菌体蛋白代替HisCLU 融合蛋白)在相应位置出现Mr为26000阳性条带, 阴性对照(兔免疫前血清代替兔抗CLU抗血清)在相应位置无条带(图2)。

　　图2 兔抗CLU抗血清特异性的Western blot鉴定(略)

　　Fig 2 Characterization of specificity of rabbit antiserum against CLU by Western blot

　　1: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 2: HisCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 3: Blank PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 4: Lysates of E.coli BL21; 5: Protein marker; 6: Adult liver proteins.

　　2.3 杂交瘤的细胞株的建立及Ig亚类的测定 经细胞融合, 筛选及克隆化, 获得9株能稳定分泌抗CLU mAb的杂交瘤细胞株(FAF052、 FAA054、 FBE063、 FDC067、 FAF056、 FCG105、 DF103、 DC0957和DG025)。Ig亚类的测定结果显示, mAb 均为IgG1亚类。

　　2.4 mAb的特异性鉴定 (1)Western blot显示: 杂交瘤FAA054、 FAF052、 FBE063、 FCG105、 DF103、 DG025、 DC0957的培养上清能同时检测到GSTCLU和HisCLU, 表明这7株mAb可特异地识别CLU蛋白。(2)间接免疫荧光检测, 将HepG2细胞以1×108/L的浓度铺6孔板, 培养48 h后, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清, 4℃过夜后, 加FITC羊抗鼠IgG, 在荧光显微镜下观察, 只有杂交瘤FCG105和DC0957的培养上清在HepG2细胞质中呈现明显的绿色荧光(图3)。(3)免疫组化染色, 用分泌抗CLU杂交瘤细胞的培养上清检测成人肝脏组织, 杂交瘤FCG105、 DC0957、 FAF052、 FDC103在肝细胞质中有CLU的表达(图4)。提示了此7种抗CLU的mAb中, FCG105、 DC0957具有更好的稳定性, 敏感性和特异性。mAb特异性鉴定结果(表1)。

　　图3 CLU 在 HepG2细胞中表达的间接免疫荧光染色检测(略)

　　Fig 3 Detection of CLU expression in HepG2 cells by indirect immunofluorescence staining (×400)

　　A: Negative control: normal mouse serum (1∶1000); B: Culture of supernant of hybridoma cell FCG105.

　　图4 成人肝组织中CLU表达的免疫组化染色检测(略)

　　Fig 4 Detection of CLU expression in adult liver tissue by indirect immunohistochemistry staining (×400)

　　A: Negative control: normal mouse serum (1∶1000); B: Culture of supernant of hybridoma cell FCG105.

　　表1 抗 CLU mAb特异性鉴定(略)

　　Tab 1 Characterization of antiCLU mAb specificity

　　3 讨论

　　CLU 基因定位于人类染色体8p21, 含有1651个碱基, 编码449个氨基酸的糖蛋白, 是一种多功能蛋白。生理条件下, CLU蛋白主要参与脂质转运、 组织重建、 细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程。病理条件下, CLU 蛋白在乳腺癌组织中表达上调, 可以通过抑制细胞凋亡而促进肿瘤发展, 已被证实与该肿瘤侵袭性的生物学行为有关[5]。Miyake等[7]研究发现, CLU基因mRNA水平的上调与膀胧癌术后复发及预后密切相关; 在肾癌 ACHN 细胞株中, CLU 基因导入可以明显增强肿瘤细胞的转移能力[1, 8]。近年来研究结果显示, CLU 基因可通过抗细胞坏死或抗凋亡机制, 发挥细胞保护作用, 从而促进肿瘤生长。Yamanaka等[9]应用反义寡核苷酸阻断前列腺LNCaP细胞株中CLU基因表达, 发现诱导了LNCaP细胞的凋亡和增加其化学敏感性。Trougakos等[10]应用RNA干扰技术(siRNA)转染肿瘤细胞, 证实CLU基因在mRNA转录后的沉默, 可以显著诱导细胞凋亡; 然而针对特异性CLU变体的siRNA, 将产生不同的作用效果, 针对特异性sCLU的siRNA的敲除, 将增加细胞毒素制剂的功效; 而针对nCLU的siRNA的敲除, 将发挥其针对各种化学治疗的细胞保护作用。最近研究显示, 通过下调体外培养的恶性肿瘤细胞中CLU基因表达, 可以增强抗癌药物顺铂(cisplatin)诱导细胞凋亡的能力, 从而提高顺铂的化疗敏感性[11], 提示CLU基因有望成为临床治疗恶性肿瘤的新基因靶点。但是目前, CLU 基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。

　　本研究中, 我们利用原核表达技术, 表达了 GSTCLU和HisCLU融合蛋白, 并以GSTCLU为免疫原, 以HisCLU为检测原(排除单抗筛选时GST标签蛋白的干扰), 免疫家兔和BALB/c小鼠成功制备了兔抗CLU抗血清和9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株, 其亚类均为IgG1。对其进行了特异性分析, 实验结果显示免疫兔血清中产生了抗CLU和GST的抗体, 这些抗体可特异识别重组表达的CLU蛋白, 并可特异识别天然状态下的CLU蛋白; 9株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株中, mAb FAF052、 FBE063、 FAA054、 FCG105、 DF103、 DG025、 DC0957在Western blot检测中能特异性识别CLU蛋白, mAb FCG105、 DC0957可用于间接免疫荧光染色检测细胞中表达的CLU蛋白, 其主要定位于细胞质中, mAb FCG105、 DC0957、 FAF052、 FDC103可用于免疫组化染色检测CLU在成人肝脏组织肝细胞质中的表达。由于抗CLU抗血清和mAb对CLU具有很好的识别特性, 因此为进一步研究CLU在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制提供了必要的工具。

　　【参考文献】

　　[1] Miyake H, Gleave ME, Arakawa S, et al. Introducing the clusterin gene into human renal cell carcinomas cell enhances their metastatic potential[J]. J Urol, 2002, 167(5): 2203-2208.

　　[2] Criswell T, Klokov D, Beman M, et al. Repression of IRinducible clusterin expression by the p53 tumor suppressor protein[J]. Cancer Biol Ther, 2003, 2(4): 372-380.

　　[3] Trougakos IP, Gonos ES. Clusterin/apolipoprotein J in human aging and cancer[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2002, 34(11): 1430-1448.

　　[4] Xie D, Lau SH, Sham JST, et al. Upregulated expression of cytoplasmic clusterin in human ovarian carcinoma[J]. Cancer, 2005, 103(2): 277-283.

　　[5] 高 媛, 杨金菊, 柳晓兰, 等. 兔抗人CXCR3B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 223-226.

　　[6] 杜雪梅, 唐 丽, 柳晓兰, 等. 抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(4): 517-520.

　　[7] Miyake H, Gleave M, Kamidono S, et al. Overexpression of clusterin in transitional cell carcinoma of the bladder is related to disease progression and recurrence[J]. Urology, 2002, 59(1): 150-154.

　　[8] Chen X, Halberg RB, Ehrhardt WM, et al. Clusterin as a biomarker in murine and human intestinal neoplasia[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(16): 9530-535.

　　[9] Yamanaka K, Rocchi P, Miyake H, et al. Induction of apoptosis and enhancement of chemosensitivity in human prostate cancer LNCaP cells using bispecific antisense oligonucleotide targeting Bcl2 and BclxL genes[J]. BJU Int, 2006, 97(6): 1300-1308.

　　[10] Trougakos IP, So A, Jansen B, et al. Silencing expression of clusterin/apolipoprotein gene in human cancer cells using small interfering RNA induces spontancous apoptosis, reduced growth ability, and cell sensitization to genotoxic and oxidative stress[J]. Cancer Res, 2004, 64(5): 1834-1842.

　　[11] Chung J, Kwak C, Jin RJ, et al. Enhanced chemosensitivity of bladder cancer cells to cisplatin by suppression of clusterin in vitro[J]. Cancer Lett, 2004, 203(2): 155-161.