CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究

作者：李先平, 高美华* 作者单位：青岛大学医学院免疫学教研室, 山东 青岛 266021

　　【关键词】 CD59 短肽封条 HeLa细胞 细胞凋亡 survivin caspase 3 bax

　　Effect of peptide seals specific to CD59 on the expression of apoptosisrelated genes in HeLa cells

　　LI Xianping, GAO Meihua*

　　Department of Immunology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266021, China

　　[Abstract] AIM: To study the effect of peptide seals specific to CD59 on the expression of apoptosisrelated survivin, caspase3 and bax in HeLa cells and investigate the mechanism of peptide seals specific to CD59 in inducing apoptosis of HeLa cells. METHODS: The peptide seals specific to CD59 were put into HeLa cells and HeLa cells with CD59transfected gene, respectively. After 24 hours of interaction, the inhibitory ratio of cell proliferation was measured by MTT and the expression of survivin, caspase3 and bax was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The inhibitory ratio of HeLa cells with CD59transfected gene + peptide seal group was higher than that of HeLa cells+peptide seal group. There was a significant difference in depressing the proliferation between two groups (P<0.01). Compared with HeLa cells+peptide seal group, the survivin expression of HeLa cells with CD59transfected gene+peptide seal group was decreased (P<0.05) while caspase3 expression was increased(P<0.05). There was no significant difference in the expression of bax in four groups. CONCLUSION: The peptide seal specific to CD59 can downregulate the expression of survivin, activate caspase3 and enhance the apoptosis of HeLa cells.

　　[Keywords]CD59; peptide seal; HeLa cells; apoptosis; survivin; caspase3; bax

　　CD59是补体终末段的一种调节蛋白, 具有抑制补体攻膜复合物的形成, 保护细胞免遭补体介导的溶细胞作用。Fonsatti等[1]研究发现CD59与肿瘤的生长失控及转移密切相关。由于在大多数实体瘤细胞膜表面存在或者高表达CD59 等一系列的膜补体调节蛋白, 使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体(mAb)治疗中由补体介导的溶细胞作用[2, 3], 免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因。目前, 在实体肿瘤的免疫治疗中, 一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。国内外学者研究证实, CD59分子中N37～H44位氨基酸与人类糖尿病血管增殖症的发生密切相关[4], 但与肿瘤逃逸信号密切相关的CD59活性位点的研究国内外鲜有报道。本课题组利用噬菌体肽库筛选技术体外合成可阻断与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条[5]。我们采用本课题组设计的与人CD59特异结合的短肽封条作用于HeLa细胞, 观察其对HeLa细胞的促凋亡作用, 并探讨其诱导HeLa细胞凋亡的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 CD59特异位点的短肽封条(1000 mg/L)由本课题组设计, 送北京中科亚光生物科技有限公司合成; HeLa细胞由本实验室保存; 转CD59基因HeLa细胞由中国海洋大学的李冰博士惠赠; survivin、 caspase3及bax免疫组化试剂购于武汉博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 在含有80 mL/L胎牛血清, 青霉素及链霉素各100 mg/L 的RPMI1640 培养液中, 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养细胞, 每48 h换液传代1次, 取生长良好的细胞进行实验。

　　1.2.2 MTT的检测 采用MTT测定法观察CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞和转CD59基因的HeLa细胞的影响。实验设空白对照组, HeLa细胞组, 转CD59基因的HeLa细胞组, HeLa细胞+短肽组和转CD59基因的HeLa细胞+短肽组。每组做8个孔, 每孔做3个复孔。采用培养的对数生长期的细胞, 以每孔1×105个细胞接种于96孔培养板, 每孔加150 μL的RPMI1640完全培养液。培养48 h后, 给细胞换液。空白对照组, HeLa细胞组及转CD59基因的HeLa细胞组仍旧每孔加150 μL的RPMI1640完全培养液; HeLa细胞+短肽组和转CD59基因的HeLa细胞+短肽组每孔加入150 μL含有CD59特异位点的短肽封条50 mg/L的RPMI1640完全培养液。作用24 h后加入MTT液, 再培养4 h。吸弃孔中的培养上清, 每孔加入150 μL DMSO, 混匀10 min, 在ELX800酶标仪570 nm处测定各孔吸光度值(A), 抑制率={1-[(实验组平均A值-空白对照组平均A值)/(对照组平均A值-空白对照组平均A值)]｝×100%。重复3次取平均值。

　　1.2.3 survivin、 caspase3及bax的免疫组织化学染色 采用培养的对数生长期的细胞, 以每孔2×105个细胞接种于24孔培养板(每孔铺有一小块盖玻片), 每孔加1000 μL的RPMI1640完全培养液。实验设HeLa细胞组(Ⅰ组); 转CD59基因的HeLa细胞组(Ⅱ组); HeLa细胞+短肽组(Ⅲ组); 转CD59基因的HeLa细胞+短肽组(Ⅳ组)。培养48 h后, 给细胞换液, Ⅰ组和Ⅱ组仍然每孔加1000 μL的RPMI1640完全培养液。Ⅲ组和Ⅳ组每孔加入1000 μL含有CD59特异位点的短肽封条50 mg/L的RPMI1640完全培养液。再培养24 h, 取出盖玻片用40 g/L的多聚甲醛固定。固定0.5 h后, 取出盖玻片进行免疫组织化学染色。免疫组织化学的染色步骤按照试剂盒的说明书操作。免疫组织化学染色胞质或/和胞核棕黄色为阳性结果。参照姚济芬等[6]的方法, 随机选取5个高倍视野(×400), 首先根据阳性细胞所占的百分比记分, 阳性细胞数<5%为0分, 5%～25%为1分, 26%～50%为2分, 51%～75%为3分, 76%～100%为4分。再根据阳性细胞显色强度记分: 无着色为0 分, 轻度染色为1分, 中度染色为2分, 重度染色为3分, 二者得分之和即为阳性蛋白表达, 其中<1分为阴性, 2～3 分为弱阳性(+), 4～5分为中等阳性(++), 6～7 分为强阳性(+++)。

　　1.2.4 统计学处理 采用t检验和秩和检验。全部统计处理均在SPSS10.0软件上进行。

　　2 结果

　　2.1 细胞增殖抑制率的比较 HeLa细胞+短肽组和转CD59基因的HeLa细胞+短肽组的细胞增殖抑制率分别为: (29.85±2.95)%和(36.22±4.68)%。组间比较差别有统计学意义(P<0.01, 表1)。

　　表1 MTT试验各组的吸光度值(略)

　　Tab 1 The quantity of absorbance of five groups in MTT test

　　2.2 细胞免疫组织化学染色 Survivin阳性染色主要定位于细胞质, 也可见细胞核着色(图1), caspase3和bax阳性染色主要定位于细胞质(图2、 3)。

　　图1 Survivin在各组HeLa细胞中的表达(略)

　　Fig 1 The expressions of survivin in the HeLa cells (IHC, ×400)

　　A: HeLa cells; B: HeLa cells with CD59transfected gene; C: HeLa cells+peptide seal; D: HeLa cells with CD59transfected gene+peptide seal.

　　图2 caspase3在各组HeLa细胞中的表达(略)

　　Fig 2 The expressionsofcaspase3intheHeLacells (IHC,×400)

　　A: HeLa cells; B: HeLa cells with CD59transfected gene; C: HeLa cells+peptide seal; D: HeLa cells with CD59transfected gene+peptide seal.

　　图3 Bax在各组HeLa细胞中的表达(略)

　　Fig 3 The expressions of bax in the HeLa cells (IHC, ×400)

　　A: HeLa cells; B: HeLa cells with CD59transfected gene; C: HeLa cells+peptide seal; D: HeLa cells with CD59transfected gene+peptide seal.

　　2.3 survivin、 caspase3及bax的表达的比较 通过SPPS10.0统计学软件秩和检验分析结果表明: Ⅲ组和Ⅰ组相比较, Ⅳ组和Ⅱ组相比较, Ⅳ组和Ⅲ组相比: survivin的表达量显著降低(P<0.05); Ⅲ组和Ⅰ组相比较, Ⅳ组和Ⅱ组相比较, Ⅳ组和Ⅲ组相比: caspase3的表达量显著升高(P<0.05); bax的表达量各组比较(Ⅲ组和Ⅰ组, Ⅳ组和Ⅱ组, Ⅳ组和Ⅲ组)变化不大, 差别无统计学意义(P>0.05, 表2)。

　　表2 四组细胞survivin、 caspase3、 bax表达的比较(略)

　　Tab 2 The comparision of survivin, caspase3, bax expression levels of four groups

　　3 讨论

　　近年来, 国外报道已在多种实体肿瘤细胞中如肠道、 卵巢、 前列腺等发现有CD59分子的过表达, 并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。因此CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点。但作为与肿瘤逃逸信号密切相关的CD59活性位点的研究国内外未见相关报道。本课题组已经利用噬菌体显示技术和生物信息技术从噬菌体随机12肽库中对转染人CD59的CHO细胞进行全细胞筛选, 经过5轮亲和富集筛选后, 得到3条高度同源的多肽序列: HSACDLLMHPMC,HSACDLPMHPMC,HSACDLPKAPWC, 运用DNA STAR软件进行分析, 3种序列与已公布的CD59的天然配体CD2(PubMed: 339HGAAENSLSPSS)都含有H×A××××××P××一级结构。而且, HGAAENSLSPSS含有10个疏水性氨基酸, 与获得的含有9个疏水性氨基酸的3种序列比较接近。测序后的碱基序列转换为氨基酸序列, 并将一致性的短肽序列提交PIR国际蛋白质数据库(http://pir.georgetown.edu/)进行查询比对, 进行同源性分析, 未发现有同源性一致的序列。将同源性高的序列送北京中科亚光生物科技有限公司进行短肽合成。体外合成了与人CD59分子特异结合的短肽封条。

　　Survivin基因是近几年分离鉴定的, 是目前所发现的最强的凋亡抑制基因[7]。survivin编码产生含142个氨基酸的蛋白, 主要通过抑制caspase3、 caspase7蛋白酶活性而抑制细胞凋亡[8]。其过量表达可能导致肿瘤细胞逃避细胞周期检测点, 从而使肿瘤细胞逃避凋亡, 实现异常增殖, 导致肿瘤的形成。本研究结果证明转CD59基因的HeLa细胞+短肽组(Ⅳ组)的survivin的表达水平和其他组比较明显降低(P<0.05), 由此证明特异性的短肽封条与HeLa细胞膜上的CD59结合后, 能抑制survivin的表达。survivin可直接作用于caspase3和caspase7, 一方面可以与有活性的caspase3和caspase7特异性结合, 当caspase3与survivin结合后, 即在细胞内失活; 另一方面survivin也能阻止caspase3和caspase7的自发激活, 从而抑制细胞的凋亡。本研究结果证明转CD59基因的HeLa细胞+短肽组(Ⅳ组)的caspase3的表达水平和其他组比较显著增加(P<0.05), 可能是由于特异性的短肽封条抑制了survivin的表达, 从而解除了survivin对caspase3活化的抑制所致。bax能与细胞中bcl2结合, 这种结合对bcl2基因抗凋亡起重要调控作用, 如果bax基因占优势时细胞凋亡, 而bcl2基因占优势时细胞生存。本研究中bax的表达在各组没有统计学意义, 说明在人CD59特异结合的短肽封条与HeLa细胞结合诱导的凋亡通路中, bax起次要的作用。

　　我们的研究结果显示: 转CD59基因的HeLa细胞+短肽组的细胞增殖抑制率高于HeLa细胞+短肽组, 差别有统计学意义, 这从另外的角度证明CD59在促进肿瘤细胞的凋亡中扮演重要的角色。免疫组织化学中的Ⅲ组和Ⅰ组比较, Ⅳ组和Ⅱ组比较, Ⅳ组和Ⅲ组比较: Survivin的表达明显减少, caspase3的表达明显增多, 差别有统计学意义。说明CD59特异位点短肽封条确实有明显的促进HeLa细胞凋亡的作用。我们发现ACDLLM短肽存在于肿瘤坏死因子1 型受体相关蛋白(TNFR1)中。而我们合成的短肽中也含有ACDLLM短肽序列。所以我们推测短肽封条

　　和CD59的特异位点结合以后, 一条通路可能是短肽能起到类似TNFR1的作用, 引起一系列的反应, 从而激活caspase3, 引起凋亡。另外, 据Korty等报道CD59与特异的单克隆抗体交联以后, 能产生钙离子流。我们的短肽封条的一级结构和CD59的天然配体CD2有部分同源序列, 能与CD59分子紧密的结合, 产生钙离子流, 从而激活特异的酪氨酸磷酸酶, 使survivin的表达减少, 从而解除了对caspase3活性的抑制, 使caspase3的表达量增多, 从而促进HeLa细胞凋亡。关于短肽封条引起凋亡的进一步机制, 我们课题组将在动物实验中做进一步的研究。我们的研究为肿瘤的免疫逃逸和靶向治疗研究提供了一种全新的理念及实验依据, 具有重要的理论价值及广阔的临床应用前景。

　　【参考文献】

　　[1] Fonsatti E, Altomonte M, Coral S. Emerging role of protectin (CD59) in humoral immunotherapy of solid malignancies[J]. Clin Ter, 2000, 151(3): 187-193.

　　[2] Fisheison Z, Donin N, Zell S, et al. Obstacles to cancer immunotherapy : expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumors[J]. Mol Immunol, 2003, 40(2/4): 109-123.

　　[3] Den C, Fonsatti E, Sigalotti L, et al. Recombinant transmembrane CD59(CD59TM) confers complement resistance to GPIanchored protein defective melanoma cells[J]. J Cell Physiol, 2002, 190(2): 200-206.

　　[4] Acosta J, Hettinga J, Flückiger R, et al. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(10): 5450 -5455.

　　[5] 程 颖, 高美华. 利用噬菌体肽库筛选与人CD59特异性结合的短肽[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(2): 164-166.

　　[6] 姚济芬, 郑 伟, 石一复, 等. 血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶MMP2, MMP9在子宫癌中的表达的免疫组化研究[J]. 中国实验诊断学, 2002, 6(2): 72-75.

　　[7] Ikehara M, Oshita F, Kameda Y, et al. Expression of survivin correlated with vessel invasion is a marker of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung[J]. Oncol Rep, 2002, 9(4): 835-838.

　　[8] Ambrosini G, Adida C, Sirugo G, et al. Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targeting[J]. J Biol Chem, 1998, 273(18): 11177-11182.