非小细胞肺癌组织Fas、FasL和Bcl2表达及意义

作者：牟宗宝，沈毅，杨景伟 作者单位：青岛大学医学院附属医院胸外科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 探讨Fas、FasL和B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)蛋白在非小细胞肺癌组织的表达及临床意义。方法 用免疫组化EnVison法检测60例非小细胞肺癌组织Fas、 FasL和Bcl2蛋白的表达，并分析其与病理分期、肿瘤分化和淋巴结转移的关系。同时，取癌旁5 cm以上正常肺组织18例作为对照。结果 Fas、FasL和Bcl2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达与癌旁肺组织相比差异有显著性(Hc=12.26～37.07,P<0.01)。Fas蛋白的表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关(Hc=20.21、18.31,u=-3.38,P<0.01);FasL蛋白的表达也与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关(Hc=15.09、8.61,u=-2.16,P<0.05);Bcl2蛋白的表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关(Hc=14.15、8.84，u=-3.03,P<0.01)。结论 Fas、FasL及Bcl2蛋白表达失衡与非小细胞肺癌的发生发展密切相关。

　　【关键词】 癌,非小细胞肺;抗原,CD95;蛋白质Bcl2

　　EXPRESSIONS OF Fas, FasL, AND Bcl2 IN NONSMALL CELL LUNG CANCER AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE MU ZONGBAO, SHEN YI, YANG JINGWEI (Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To explore the expressions of Fas, FasL and Bcl2 in nonsmall cell lung cancer (NSLC) and their clinical significance. Methods EnVison immunohistochemical method was used to examine the expressions of Fas, FasL and Bcl2 in 60 NSLC patients, the relationship between the expressions and pathologic staging, differentiation, and lymph node metastasis were analyzed. The normal tissue 5 cm away from the cancer was taken from 18 cases served as controls. Results The differences of expressions of Fas, FasL and Bcl2 between cancer tisue and paraneoplastic were significant (Hc=12.26-37.07,P<0.01), their expressions were correlated with TNM staging, differentiation and lymphatic metastasis, respectively (Hc=20.21,18.31,u=-3.38,P<0.01;Hc=15.09,8.61,u=-2.16,P<0.05; and Hc=14.15,8.84,u=-3.03,P<0.01). ConclusionDisbalance of the expressions of Fas, FasL and Bcl2 is closely associated with the occurrence and development of nonsmall cell lung cancer.

　　[KEY WORDS] Carcinoma, nonsmallcell lung; Antigens, CD95; Protein Bcl2

　　目前研究认为，肿瘤的发生、发展均与细胞凋亡失调有关。Fas家族和B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)家族是其中最重要的两个凋亡基因相关家族。本研究采用免疫组化EnVison法，检测Fas、FasL 和Bcl2蛋白在非小细胞肺癌组织表达，及其与肿瘤的TNM分期、分化程度和淋巴结转移的关系。以期对凋亡调节基因Fas家族和Bcl家族在非小细胞肺癌发生、发展中的作用有进一步的认识，为非小细胞肺癌诊治提供新依据。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　60例非小细胞肺癌标本取自2003年1月～2005年6月我院肺癌手术病人，均有明确病理诊断，均无肝炎、糖尿病及其他自身免疫性疾病。其中男33例，女27例;年龄27～73岁，平均51.6岁。根据WHO标准分型：鳞癌32例，腺癌28例;高分化17例，中分化22例，低分化21例;淋巴结阳性32例，阴性28例;按UICC 1997年肺癌PTNM分期标准:Ⅰ期21例，Ⅱ期13例，Ⅲ期22例，Ⅳ期4例。同时，取癌旁5 cm以上正常肺组织18例作为对照。所有标本均经40 g/L甲醛溶液固定、石蜡包埋、5 μm厚连续切片，一张行苏木精伊红染色，核实诊断;余行免疫组化检测。

　　1.2 方法

　　采用免疫组化二步法(EnVison法),鼠抗人Fas、FasL及bcl2单克隆抗体及通用型PowerVisionTM9000(PV9000) Kit，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸粘片剂均购自北京中山生物技术有限公司; PBS缓冲液、抗体稀释液为青岛大学医学院病理学教研室自行配制。具体步骤:脱蜡、水化组织切片; 体积分数0.03的H2O2去离子水孵育10 min,一抗4 ℃孵育过夜, PBS 冲洗,每次2 min,共3次;加试剂1,室温孵育20 min, PBS 冲洗,每次2 min,共3次;滴加试剂2, 室温孵育20 min, PBS 冲洗,每次2 min,共3次;应用DAB 溶液显色,自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片,光镜下观察。用已知的阳性切片作为阳性对照,用PBS 代替一抗作为阴性对照。

　　1.3 结果判断

　　采用半定量法，于200倍光镜下随机选取5个视野，各计数200个细胞。Fas蛋白阳性表达为细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒，按显色强度和阳性细胞数分成4级：阳性细胞<10%为(-);10%～25%，浅黄色为(+);26%～50%,黄色为();>50%，棕黄色为()。FasL蛋白阳性表达为细胞膜与细胞质出现棕黄色颗粒，按显色强度和阳性细胞数分成4级：阳性细胞<10%为(-);10%～25%，浅黄色为(+);26%～50%,黄色为();>50%，棕黄色为()。Bcl2蛋白阳性表达为细胞浆出现黄至棕黄色颗粒,按显色强度和阳性细胞数分成4级：阳性细胞<10%为(-);10%～25%，浅黄色为(+);26%～50%,黄色为();>50%，棕黄色为()。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS 10.0及PPMS 1.5[1]统计软件进行统计处理。

　　2 结 果

　　2.1 Fas蛋白在NSCLC组织表达

　　Fas蛋白主要表达于肺癌细胞胞膜，部分表达于细胞浆。Fas蛋白在肺鳞癌和腺癌的表达率为62.5%和46.4%，低于癌旁正常肺组织中的表达率(100.0%)，差异有显著性(Hc=37.07,P<0.01);Fas蛋白在肺鳞癌和腺癌的表达率无明显差异(P>0.05)。Fas蛋白的表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移显著相关(Hc=20.21、18.31,u=-3.38,P<0.01)。见表1。

　　2.2 FasL蛋白在NSCLC组织表达

　　FasL蛋白表达于肺癌细胞胞膜。FasL蛋白在肺鳞癌和腺癌的表达率为65.6%和71.4%，高于癌旁正常肺组织中的表达率(22.2%)，差异有显著性(Hc=14.65,P<0.01);FasL蛋白在肺鳞癌和腺癌的表达率差异无显著性(P>0.05)。FasL蛋白的表达也与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移均相关(Hc=15.09、8.61,u=-2.16,P<0.05)。见表2。 表1 NSCLC组织Fas蛋白表达与临床病理特征的关系临床病理特征Fas蛋白表达表2 NSCLC组织FasL蛋白表达与临床病理特征的关系临床病理特征FasL蛋白表达

　　2.3 Bcl2蛋白在NSCLC组织表达

　　Bcl2蛋白阳性表达为黄至棕黄色颗粒,定位于胞浆。Bcl2在肺鳞癌和腺癌的表达率为68.8%和53.6%，高于癌旁正常肺组织中的表达率(16.7%)，差异有显著性(Hc=12.26,P=0.00);Bcl2在肺鳞癌和腺癌的表达率之间无显著性差异(P>0.05)。Bcl2蛋白的表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关(Hc=14.15、8.84,u=-3.03,P<0.01)。见表3。

　　2.4 Bcl2、 Fas和FasL在NSCLC组织表达关系

　　NSCLC组织中Fas蛋白表达与Bcl2蛋白表达有明显相关性(rs′=-0.46,P<0.01)。见表4。NSCLC组织中FasL与Bcl2蛋白表达无明显相关关系(rs′=0.15,P>0.05)。见表5。5表3 NSCLC组织bcl2蛋白表达与临床病理特征的关系临床病理特征Bcl2蛋白表达表4 NSCLC组织中Bcl2与Fas蛋白表达的相互关系

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞存在多种免疫逃逸机制，与凋亡相关的Fas/FasL系统在肿瘤免疫逃逸中起着重要的作用。Fas/FasL介导肿瘤细胞免疫逃逸的主要机制为: ①肿瘤细胞表达FasL,促进Fas高表达的激活的T细胞凋亡,使肿瘤细胞逃避效应细胞杀伤和攻击,即免疫逃逸[2];②肿瘤细胞能通过基因突变、异常转录等方式表达无功能的Fas或不表达及低表达Fas分子，抵抗细胞毒T淋巴细胞(CTL)表面FasL介导的细胞凋亡，逃避CTL细胞毒作用的攻击，参与肿瘤的免疫逃逸[3]。肿瘤细胞对FasL触发信号凋亡的敏感性主要依赖于自身表面正常Fas蛋白的表达水平及CTL和NK细胞表面正常FasL蛋白的表达[4]。

　　本研究结果显示,Fas蛋白在NSCLC组织中的表达显著低于癌旁正常肺组织(P<0.01)，而FasL蛋白在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(P<0.01)，说明Fas/FasL 系统表达异常与NSCLC的发生密切相关。Fas蛋白表达降低可有效地逃避机体免疫细胞对肿瘤细胞的监视杀伤,使肿瘤细胞不断增殖;另一方面FasL蛋白的高表达,通过提高对局部免疫活性细胞的杀伤,使癌变细胞得以逃避免疫攻击,从而无限度增殖下去，这可能是NSCLC发生过程中的一个重要事件[5]。

　　Bcl2是20世纪80年代初期发现的原癌基因。其激活可抑制细胞凋亡的发生,为细胞恶变提供条件[6]。本实验结果显示，Bcl2在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织，说明Bcl2过表达与NSCLC发生相关。本实验还显示，NSCLC组织中Fas蛋白表达与Bcl2蛋白表达有着明显相关性，而FasL与Bcl2蛋白表达无明显相关关系。由此我们推测，非小细胞肺癌组织细胞在Fas蛋白表达低下及FasL和Bcl2蛋白表达增高的情况下，可能难以进行正常的凋亡活动，破坏了细胞增殖与凋亡的动态平衡，这可能是非小细胞肺癌形成及进展的原因之一，但三者之间的内在联系和确切机制尚有待进行更深入的研究。

　　本研究结果还显示，Fas、FasL及Bcl2蛋白的表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关，提示其可以作为判断NSCLC发展程度及其预后的重要指标。

　　总之，我们认为有必要进行大样本前瞻性随机对照研究，以验证将NSCLS组织癌细胞中Fas、FasL及Bcl2表达作为判断NSCLC发展程度及其预后指标的可行性。

　　【参考文献】

　　[1]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

　　[2]刘传杰;张杰. FasL基因表达调控研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2004,24(4):711.

　　[3]张明刚,曹雪涛(审校). Fas/FasL系统、杀伤性DC与免疫耐受[J]. 国外医学:免疫学分册, 2004,27(5):267270.

　　[4]MAHER S, TOOMEY D, CONDRON C, et al. Activationinduced cell death:the controversial role of Fas and Fas ligand in immune privilege and tumour conterattack[J]. Immunol Cell Biol, 2002,80(2):131137.

　　[5]杨景伟,魏煜程. Fas和Ki67在非小细胞肺癌组织中的表达[J]. 齐鲁医学杂志, 2007,22(3)：212.

　　[6]MANNE U, WEISS H L, GRIZZLE W E. Bcl2 expressions associated with improved prognosis in patients with distal colorectal adenocarcinomas[J]. Int J Cancer, 2000,89(5):423430.