人endostatin、 K5及endostatinK5重组腺病毒载体的构建及其表达

作者：李慧瑾, 张伟锋, 王东阳, 李荣华, 齐宗利, 赵俊丽, 夏海滨 作者单位：陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室, 陕西 西安 710062

　　【摘要】 目的: 人endostatin、 K5及endostatinK5基因克隆, 重组腺病毒载体的构建及其表达产物体外活性检测。方法: 采用PCR方法扩增基因, 通过酶切连接方法将3种基因片段克隆到腺病毒shuttle载体pAd5CMVH1H2MCS6His中; 用磷酸钙沉淀法分别将经Pac I酶切的表达人endostatin、 K5及endostatinK5的腺病毒shuttle载体与Pac I酶切的腺病毒骨架共转染HEK 293细胞; 用CsCl密度梯度离心法纯化制备病毒; 用重组腺病毒感染HeLa细胞并在不同时间点收获蛋白, Western blot检测24 h、 48 h和72 h的蛋白表达量; 通过MTT方法检测蛋白对ECV304生长抑制作用。结果: 成功制备表达人endostatin、 K5及endostatinK5重组腺病毒载体; Western blot可以检测到蛋白表达, 蛋白表达量随病毒感染HeLa细胞的时间延长而逐渐增高; 由重组腺病毒所表达的3种蛋白对ECV304细胞均有明显的生长抑制作用。结论: 由含有人endostatin、 K5及endostatinK5基因的重组腺病毒载体所表达的蛋白对ECV304生长具有明显的抑制作用。

　　【关键词】 endostatin; K5; 腺病毒载体; MTT检测; 肿瘤

　　Construction and expression of recombinant adenovirus vector carrying human endostatin, K5 and endostatinK5 gene

　　LI Huijin, ZHANG Weifeng, WANG Dongyang, LI Ronghua, QI Zongli, ZHAO Junli, XIA Haibin*

　　Laboratory of Gene Therapy, College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China

　　[Abstract] AIM: To construct the recombinant adenoviral vectors expressing human endostatin, K5 and endostatinK5 gene respectively, and study their bioactivity in vitro. METHODS: Human endostatin, K5 and endostatinK5 gene were amplified by PCR, which were then subcloned into shuttle vector pAd5CMVH1H2MCS6His by enzyme and ligation respectively. The positive recombinant plasmids linearized by Pac I were cotransfected into HEK 293 cells with the Pac I linearized adenoviral backbone plasmid using calcium phosphate precipitation method. The recombinant viruses were purified by CsCl density gradient centrifugation. The protein expression at different time points (24 h, 48 h and 72 h) was determined by Western blot. The inhibitory effect of the protein on ECV304 growth was detected by MTT. RESULTS: The recombinant adenoviral vectors expressing human endostatin, K5 and endostatinK5 gene were successfully constructed in HEK293 cells. Protein expression was detected by Western blot. The level of protein expression was increased with the prolonged incubation of the infected HeLa cells. Three kinds of the protein expressed by the recombinant adenoviral vectors showed obvious inhibitory effect on ECV304 cell growth. CONCLUSION: The protein expressed by adenoviral vectors carrying endostatin, K5 and endostatinK5 gene has an obvious inhibitory effect on ECV304 cell growth.

　　[Keywords]endostatin; K5; adenoviral vector; MTT test; tumor

　　肿瘤是目前严重威胁人类健康的疾病之一, 而肿瘤血管生成对肿瘤生长、 转移和侵袭有重要作用, 因此抗血管生成将成为肿瘤治疗的一种有效途径。肿瘤血管生成由一系列级联反应所致, 这种反应能否发生取决于血管生成促进因子和抑制因子二者之间的平衡状态。当血管生成促进因子表达或产生高于血管生成抑制因子时, 肿瘤血管便开始形成。其中研究最为广泛的抑制血管生成因子主要包括内皮他丁(endostatin)[1]、 血管他丁(angiostatin)(K1K4)[2]、 tumostatin[3]和canstatin[4]。不同分子的作用机制不同, endostatin能特异地通过与成纤维母细胞生长因子(FGF)竞争及通过阻止G0/G1期向S期转变等途径抑制内皮细胞增殖[1], 从而导致细胞内信号通路改变并明显抑制肿瘤的生长和转移。纤溶酶原 (plasminogen)作为一种血液蛋白, 可以通过酶解产生包含5个环状结构域的血管生成抑制分子, 其中angiostatin(K1K4)抑制血管生成的机制可能主要与其下调VEGF表达、 能通过与内皮细胞表面ATP合成酶α亚单位结合使内皮细胞增殖抑制。研究表明Kringle 5(K5)比angiostatin有更强的抑制血管生成活性[5]。我们将分别构建endostatin、 K5及endostatinK5融合基因重组腺病毒载体, 并进行3种重组病毒载体在体外的表达研究, 为抗血管生成的肿瘤治疗研究提供新的手段。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 HEK 293细胞、 HeLa细胞购自美国ATCC公司, ECV304细胞购自上海细胞生物学研究所。细胞培养基DMEM购自美国Gibco公司, 新生牛血清购自杭州四季青公司。所有细胞培养于含有100 mL/L新生牛血清、 100 mg/L青霉素及1×104 U/L链霉素的DMEM培养液中。含有信号肽及蛋白标签的腺病毒shuttle载体pAd5CMVH1H2MCS6His及腺病毒骨架为本实验室构建; T载体pGEMTeasy购自Promega公司; E.coli DH5, E.coli BJ5183等菌株由本室保存; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶为Fermentas公司产品; DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司; DNA Marker为Hybigen公司产品; MTT、 DMSO购自Sigma公司; 针对His的鼠源性单克隆抗体(mAb)为TIANGEN公司产品、 山羊抗小鼠IgG辣根酶标记为中杉金桥公司产品。PCR所用引物均由上海生工合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 目的基因克隆 以人cDNA文库为模板, 采用引物1: endo Cla I for: 5′AATCGATATGCACAGCCACCGCGACTTCCA3′与引物2: endo Xba I no stop back: 5′TTCTAGACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG3′扩增获得的片段1称为endstatin基因片段; 采用引物3: K5 Cla I for 5′AATCGATTGTATGTTTG GG AATGGGAA AGGA TAC3′与引物4: K5 Xba I no stop back: 5′ATCTAGAAGG GGCCGCACA CTGAGGGACATCACA3′扩增获得的片段2称为K5基因片段; 采用引物1及引物5: endo BamH I back: 5′AGGATCCCGCCACCTCCAG ATCCGCCACCTCCCT TGGAGGCAGTCATGAA3′扩增获得的片段3在3′含有linker及BamH I位点序列, 将之称为endolinkerBamH I基因片段; 采用引物4与引物6: K5 Bgl II for 5′AAGATCTGGAGGTGGCGGATCTTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATAC3′扩增获得的片段4在5′含有Bgl II 位点, 将之称为Bgl IIK5基因片段(所有下划线部分为酶切位点)。PCR反应程序: 95℃预变性5 min, 进入循环扩增阶段: 95℃ 50 s → 55℃ 40 s → 72℃ 60 s, 循环30次, 最后72℃, 10 min。PCR产物电泳后回收以上4种目的片段, 通过T4 DNA连接酶将目的基因克隆到pGEMTeasy载体中, 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞, 涂布于含Amp抗性的LB平板, 挑取单克隆进行酶切、 测序鉴定获得阳性克隆。所获得阳性克隆载体分别命名为pGEMT/endostatin、 pGEMT/K5、 pGEMT/endostatinlinkerBamH I及pGEMT/Bgl IIK5。

　　1.2.2 重组腺病毒表达载体的构建 将测序鉴定正确的阳性克隆载体pGEMT/endostatin、 pGEMT/K5经Cla I与Xba I酶切后得到人endostatin或人K5基因片段, 分别将其连至带有分泌信号肽及His标签的腺病毒shuttle载体pAd5CMVH1H2MCS6His中, 获得重组载体pAd5CMVH1H2endostatin6His 、 pAd5CMVH1H2K56His。

　　将阳性克隆载体pGEMT/endostatinlinkerBamH I经Cla I与BamH I酶切后得到人endostatinlinker基因片段, 然后克隆到中间载体pAd1652中获得载体pAd1652/endostatinlinker。 pGEMT/Bgl IIK5经Bgl II与Xba I 酶切后得到人K5基因片段, 将其与经BamH I与Xba I酶切后的pAd1652/endostatinlinker载体连接, 获得阳性克隆pAd1652/endostatinK5。将pAd1652/endostatinK5经Cla I与Xba I酶切后得到的人endostatinK5基因片段克隆到pAd5CMVH1H2MCS6His中, 获得载体pAd5CMVH1H2endostatinK56His。

　　将经Pac I线性化的带有目的基因的腺病毒shuttle载体与Pac I线性化的腺病毒骨架载体共转染于HEK 293细胞中。转染7～10 d后收获病毒原液, 然后在HEK 293细胞中扩增。采用CsCl密度梯度离心法纯化重组病毒颗粒, NanoDrop测滴度, 计算公式如下: 病毒滴度(pt/L)=A260×(1.1×1015)。所获得的重组腺病毒载体分别命名为Ad5CMVendostatinhis、 Ad5CMVK5his、 Ad5CMVendostatinK5his。

　　1.2.3 Western blot分析 将含有相同的病毒量(MOI)的重组腺病毒及对照腺病毒(即不表达任何基因的腺病毒)接种于含20 mL/L NCS DMEM的150 mm培养皿的Hela细胞中, 2 h后换为50 mL/L NCS DMEM。分别在细胞感染的不同时间点(24 h、 48 h、 72 h)收获HeLa细胞的蛋白上清。取15 μL蛋白上清加等量2×上样缓冲液, 95℃煮沸10 min, 150 g/L SDSPAGE后半干转至PVDF膜, 然后PVDF膜加含有针对His标签的一抗室温孵育1 h, PVDF膜经充分洗涤然后加羊抗小鼠IgG辣根酶标记的二抗避光室温孵育1 h, 最后采用ECL显色。

　　1.2.4 细胞生长抑制作用的检测 采用MTT方法[6]检测细胞生长活性: 取对数生长期的ECV304细胞, 胰酶消化接种于96孔板, 每孔细胞数为2×103个。每次设空白组(培养基)、 对照组(来源于对照腺病毒感染的Hela细胞上清)、 3种蛋白处理组, 每组设5个复孔, 其中蛋白处理组的蛋白是由采用相同MOI的重组腺病毒感染HeLa细胞72 h后收获所得。分别培养24 h、 48 h、 72 h、 96 h后加入5 g/L的MTT 20 μL, 继续培养4 h后去掉培养基, 加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL, 水平摇床室温作用10 min。测A570值。

　　1.2.5 统计学分析 MTT方法所获得数据用SPSS13.0软件进行统计分析, 各组间差异比较采用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 基因克隆的鉴定 以人cDNA文库为模板、 分别以特异性引物进行PCR 扩增后, 用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 与endostatin(552 bp)、 K5(152 bp)预期长度一致(图1A、 B)。扩增的片段分别与pGEMTeasy载体连接, 经EcoR1酶切鉴定获得阳性克隆。测序表明, 所克隆DNA序列与GeneBank报告的endostatin、 K5基因序列完全相符(图1C)。而endostatinK5融合蛋白基因的克隆是通过将克隆获得的endostatinlinkerBamH I、 Bgl IIK5基因片段分步连接至中间载体pAd1652中构建完成。此融合蛋白基因由一含有15氨基酸的linker ( G4SG4SG4S)将endostatin及K5两个基因连接而形成的。

　　2.2 重组腺病毒表达载体的构建及其表达 将含有3个基因片段的阳性克隆载体经Cla I与Xba I酶切回收后与经Cla I与Spe I酶切后的pAd5CMVH1H2MCS6His腺病毒shuttle载体连接, 获得的克隆经Xho I+Sal I酶切鉴定分析, 若片段大小为850 bp则为阴性克隆(即载体本身), 而我们获得的克隆经以上酶切后分别约为1 000 bp、 1 400 bp、 1 750 bp的DNA片段, 表明有外源基因插入, 并且所插入的片段与预期endostatin(552 bp)、 K5(152 bp)、 endostatinK5(879 bp)长度相符(图2)。由此鉴定所获得的克隆为阳性克隆。

　　将经Pac I线性化的带有目的基因的腺病毒shuttle载体与Pac I线性化的腺病毒骨架载体共转染于HEK 293细胞中。收获病毒原液, 经扩增及CsCl密度梯度离心法纯化后, 见明显的单一的病毒条带。经NanoDrop测得A260值并计算滴度, 重组腺病毒载体Ad5CMVendostatinhis、 Ad5CMVK5his、 Ad5CMVendostatinK5his滴度分别为: 0.69×1015 pt/L、 2.91×1015 pt/L、 1.77×1015 pt/L。在病毒感染HeLa细胞后不同时间点收获蛋白上清, 采用Western blot 检测蛋白表达。结果表明: 随着病毒感染后细胞培养时间的延长, 蛋白endostatin、 endostatinK5表达量也在逐渐增加(图3)。

　　2.3 表达蛋白在体外对细胞生长的抑制作用 将重组腺病毒或对照腺病毒感染HeLa细胞72 h后所收获的上清加入ECV304细胞中, 分别作用24 h、 48 h、 72 h和96 h后采用MTT法测定A570值。实验结果表明, 同对照组相比较3种蛋白对ECV304细胞生长具有抑制作用(图4)。

　　3 讨论

　　腺病毒载体是目前用于肿瘤基因治疗研究最常用的病毒载体之一。腺病毒载体具有滴度高、 容量大、 不整合到染色体中、 对人致病性低等特点[7]。本研究中我们成功构建了3种重组腺病毒载体, 并进行了体外表达研究。Western blot结果表明随着病毒感染时间的延长, K5、 endostatin、 endostatinK5蛋白表达量逐渐增高。在检测K5蛋白表达量的过程中, 起初我们使用0.45 μm孔径的NC膜进行转移未能检测到其表达, 随后采用0.22 μm孔径的PVDF膜可以明显检测到K5蛋白表达。这可能与K5蛋白Mr小(约9 000)有关, 因此采用孔径小及吸附能力强的PVDF膜将会有助于小Mr蛋白的检测。

　　Endostatin是在培养鼠血管内皮瘤细胞过程中发现的一种相对Mr为20 000的胶原蛋白XVIII羧基末端水解片段。Endostatin作为一种内源性抗血管生成物质, 可特异性作用于内皮细胞尤其是微血管内皮细胞, 可抑制内皮细胞迁移并诱导其凋亡, 从而抑制血管生成和肿瘤生长, 并且无耐药性和毒副作用。纤溶酶原片段有5个环状结构域, 其蛋白水解片段具有抑制血管增生活性, 其中K5比angiostatin(K1K4)活性更强。K5可抑制内皮细胞的增殖、 通过诱导细胞周期停滞发挥作用, 具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值。鉴于已有相关研究endostatin和angiostatin融合表达可有效协调发挥抗血管生成作用[8], 我们在单独构建表达人endostatin与K5的同时, 为了探讨具有不同抗血管生成功能的因子是否具有协同作用, 构建了endostatinK5 融合蛋白基因。构建融合蛋白有多种方法, 在构建此融合蛋白时, 我们巧妙地将目的基因分步连接至中间载体中, 并在endostatin与K5之间插入一个由15个氨基酸(G4SG4SG4S)组成的linker, 从而可以保证两个蛋白功能的正常发挥。此外, 当96 h endostatinK5融合蛋白对ECV304细胞的抑制作用比单独endostatin强(P<0.05)。该结果为研究3种蛋白在体内对肿瘤生长的抑制效果提供了基础。

　　【参考文献】

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　　[2] Schmitz V, Raskopf E, GonzalezCarmona MA, et al. Plasminogen derivatives encoding kringles 14 and kringles 15 exert indirect antiangiogenic and direct antitumoral effects in experimental lung cancer[J]. Cancer Invest, 2008, 26(5): 464-470.

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　　[6] Li XP, Li CYS, Li XH, et al. Inhibition of human nasopharyngeal carcinoma growth and metastasis in mice by adenovirusassociated virusmediated expression of human endostatin[J]. Mol Cancer Ther, 2006, 5(5): 1291-1294.

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　　[8] Li X, Liu YH, Lee SJ, et al. Prostaterestricted replicative adenovirus expressing human endostatinangiostatin fusion gene exhibiting dramatic antitumor efficacy[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(1): 291-298.