乙肝病毒外膜大蛋白含量与HBVDNA载量的相关性

　　作者：刁仁联 作者单位：(镇江市第三人民医院检验科, 江苏 镇江 212003)

　　【摘要】 目的： 探讨乙型肝炎患者血清中乙肝病毒外膜大蛋白(HBVLP)与HBVDNA水平的相关性,以及HBVLP对HBeAg阴性乙肝患者的临床应用价值。 方法： 分别采用ELISA法和实时荧光定量PCR法检测405例HBV感染者血清的HBVLP、HBeAg和HBVDNA。 结果： (1)405例HBV感染者血清中, HBVLP和HBVDNA的阳性率分别为75.06%和70.12%,两者的检出一致率为71.85%,两者间差异无统计学意义(P>0.05);(2)HBVLP含量与HBVDNA拷贝数之间呈正相关(r= 0.944,P<0.05)。(3)HBeAg阳性158例中, HBVLP和HBVDNA的阳性检出率分别是93.67%和88.61%; HBeAg阴性247例中HBVLP和HBVDNA阳性检出率分别是63.16%和58.30%,两者间差异均无统计学意义(P>0.05);(4)HBVDNA阳性284例中, HBVLP的阳性率明显高于HBeAg的阳性率,分别是83.45%和49.30%,差异有统计学意义(P<0.01) 。 结论： 乙肝病毒外膜大蛋白与HBVDNA两者间有很好的相关性，可以作为判断HBV复制的血清学指标。

　　【关键词】 乙肝病毒外膜大蛋白;HBVDNA;病毒复制

　　[Abstract] Objective: To explore the correlation between the content of HBV large envelope protein(HBVLP) and the HBVDNA load in hepatitis B patients, and to discuss the clinical application of HBVLP in hepatitis B patients HBeAg negative. Methods: Serum HBVLP and HBVM were detected by using ELISA, and the HBVDNA was quantitively detected by using real time polymerase chain reaction(RTPCR). Results: (1)In 405 serum samples of the patient with HBV infection, positive rate of HBVLP and HBVDNA were 75.06% and 70.12% .(2)The level of HBVLP and HBVDNA copies performed a nice positive correlation(r= 0.944,P<0.05). (3) No significant difference of positive rate was found between HBVLP(93.67%) and HBVDNA(88.61%) in 158 HBeAg positive serum samples, no significant difference of positive rate was found between HBVLP(63.16%) and HBVDNA(58.30%) in 247 HBeAg negative serum samples. (4) Significant difference of positive rate was found between HBVLP(83.45%) and HBeAg (49.30%) in 284 serum samples with HBVDNA positive. Conclusion: HBVLP was a sensitive index in reflecting hepatitis B virus replication level, especially to the HBeAg negative chronic hepatitis patients.

　　[Key words] HBV large envelope protein; HBVDNA; virus replication

　　乙型病毒性肝炎是我国常见的传染病，其传染性和病死率均居高不下，严重危害人们的健康[1]。乙肝病毒血清标志物(HBVM) 检测是目前诊断乙型肝炎最常用的指标,主要反映人体对乙肝病毒(HBV) 的免疫反应状态。检测HBV 标志物只能反映病毒入侵人体的信息,不能直接反映HBV 在患者体内的复制情况,也不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据,而定量检测HBVDNA 是衡量乙肝病毒传染性的最精确的指标,是确定HBV 感染不同复制状态的有效检测手段。荧光定量PCR实现对HBVDNA的定量检测,可为乙型肝炎提供准确的病原学诊断,并能为乙型肝炎的抗病毒治疗提供可靠的疗效评估。但许多基层医疗机构不具备核酸检测的能力和资质。乙型肝炎病毒外膜大蛋白(hepatitis B virus large envelope protein, HBVLP) 是HBV 的包膜蛋白,包括HBsAg 与PreS1 蛋白和PreS2 蛋白。新近的研究表明, HBVLP的前S 蛋白具有复杂的跨膜构象拓扑结构,与HBV 的感染、复制及预后密切相关[2-3]。我们检测了405例乙肝患者血清HBVLP，血清标志物和HBVDNA水平,研究三者之间的相关性,进一步分析HBVLP在临床中的应用前景。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源

　　405例为2009年9月至2010年6月我院住院乙型肝炎患者,其中男293例，女112例，年龄14～67岁。均符合2000年中华医学会修订的“病毒性肝炎防治方案”中的病毒性肝炎诊断标准，且无其他嗜肝病毒合并感染。所有标本离心后吸取血清于-80 ℃冰箱保存备用。

　　1.2 方 法

　　HBV血清标志物检测采用ELISA法,试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供;HBVLP定性检测采用ELISA法,采用针对构象型前S区的单克隆抗体,试剂盒由北京热景生物技术公司提供,Cutoff值为0.105;HBVDNA定量检测采用实时荧光定量PCR 方法,试剂盒由上海克隆生物高技术有限公司提供,检测下限为1.0×103copies/ml。以上均严格按试剂说明书操作。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示, 计数资料用率表示。HBVLP 和HBVDNA间的阳性率的比较采用χ2 检验, HBVLP含量与HBVDNA拷贝数之间相关性采用线性相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 HBVLP与HBVDNA的阳性率比较

　　405例乙型肝炎患者血清中, HBVLP的阳性率为75.06%, HBVDNA的阳性率为70.12%, 两者间差异无统计学意义(χ2=2.48，P>0.05)。HBVLP和HBVDNA检出的一致率为71.85%。结果见表1。表1 405例乙型肝炎患者中HBVLP与HBVDNA检测结果

　　2.2 血清HBVLP与HBVDNA水平之间的比较

　　以HBVLP的光密度(D值)与HBVDNA拷贝数的对数值作相关分析，405例乙型肝炎患者血清中，随着HBVDNA拷贝数的增加其血清HBVLP含量呈上升趋势，其相关系数r=0.944,P<0.05。表明HBVLP的含量与HBVDNA拷贝数之间具有正相关性。见表2。表2 HBVLP(D值)与HBVDNA拷贝数之间的关系

　　2.3 HBeAg不同模式中HBVLP与HBVDNA的阳性检出率

　　检测158例HBeAg阳性血清标本，HBVLP阳性检出率是93.67%(148/158)，HBVDNA的阳性检出率是88.61%(140/158),两者无显著性差异(χ2=2.51,P>0.05);检测247例HBeAg阴性血清标本，HBVLP阳性检出率是63.16%(156/247)，HBVDNA的阳性检出率是58.30%(144/247),两者无显著性差异(χ2=1.22,P>0.05)。

　　2.4 HBVDNA阳性血清中HBVLP与HBeAg阳性率比较

　　在284例HBVDNA阳性血清中, HBVLP的阳性率是83.45%(237/284), HBeAg的阳性率是49.30%(140/284), HBVLP的阳性率明显高于HBeAg的阳性率,两者差异有显著性统计学意义(χ2=74.22,P<0.01)。

　　3 讨 论

　　虽然HBVDNA定量检测已成为判断HBV复制最直接可靠的指标，但对于抗病毒治疗的患者来说，HBVDNA阴性并不意味着已经清除了病毒。因为肝内cccDNA的降低远远低于血清HBVDNA水平，血清HBVDNA不能真实反映肝组织内HBV复制情况[4]。许多基层医疗机构不能进行核酸检测，仅依靠HBeAg血清转换和肝功能作为判断HBV复制的指标。在部分HBeAg阴性慢性乙肝患者中，由于HBV基因前C区或CP区的变异，导致HBeAg合成障碍，HBeAg呈阴性但HBV仍存在复制现象[5]。HBeAg阴性慢性乙肝患者占乙肝患者的比例在增加，我国慢性HBV感染患者，尤其是肝硬化患者HBeAg阴性者高达60%以上[6]，因此探索新的测定简单、成本低廉的判定HBV复制的血清学指标成为目前的研究热点之一。

　　Bruns等[7] 通过研究鸭乙肝病毒发现，含有嗜肝病毒血清的感染性不仅依赖于具感染性的病毒颗粒(Dane氏颗粒)的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗粒的数量。HBVLP是HBV Dane氏颗粒和亚病毒颗粒的主要包膜成分，与HBV病毒的复制程度密切相关，在感染早期它与细胞受体结合介导病毒的内摄入，在感染晚期是病毒组装和分泌的关键。尤其是亚病毒颗粒在HBV感染过程中还能显著增强细胞内HBV的复制和基因表达，这是由于HBVLP前S区的反式激活作用所触发的。Foo等[8]证明HBVLP是导致肝细胞损伤、死亡和纤维化病变的主要原因。因此检测HBVLP对反映病毒复制情况和预后具有重要的临床意义。

　　本文研究显示405例乙肝患者中HBVLP阳性率和HBVDNA阳性率无统计学差异，两者检出一致率为71.85%，且HBVLP含量与HBVDNA的拷贝数呈正相关。HBeAg阳性和HBeAg阴性患者的HBVLP和HBVDNA阳性率差异均无统计学意义。在284例HBVDNA阳性的患者中，HBeAg阳性率仅49.30%，而HBVLP阳性率达到83.45%。这表明HBVLP对于判定乙肝患者体内病毒复制水平优于HBeAg，与HBVDNA具有相似的临床价值。在我们检测121例HBVDNA阴性的患者血清中，尚有67例HBVLP阳性，但其含量均较低。我们发现这些血清均来自处于抗病毒治疗过程中的患者，可能的原因是：① 由于抗病毒药物的应用，HBV具有的适应性和变异性导致HBV基因变异，已经设计好的商品化PCR探针引物不能与之匹配而造成漏检;② 目前的抗病毒药物只能抑制HBVDNA的复制，并不能抑制已形成的病毒表达蛋白。这一现象提示我们在HBVDNA阴性的患者中，HBVLP阳性可能是肝内病毒继续复制和抗病毒治疗不彻底的标志，但对于这一结论还需进一步研究。

　　综上所述，HBVLP可以作为判断HBV复制的新的血清学指标，尤其是在HBeAg阴性的慢性乙肝患者中具有更重要的临床应用价值。ELISA检测方法经济、简便、可行，无需专用的PCR实验室及昂贵的检测设备，值得在基层医院推广应用，有利于临床医生的诊断和治疗效果评价。

　　【参考文献】

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　　[2] Chai N, Gudima S, Chang J, et al . Immunoadhesins containing preS domains of hepatitis B virus large envelope protein are secreted and inhibit virus infection[J]. J Virol, 2007,81 (10):4912-4918.

　　[3] Patient R, Hourioux C, Sizaret PY,et al . Hepatitis B virus subviral envelope particle morphogenesis and intracellular trafficking[J]. J Virol, 2007, 81 (8):3842-3851.

　　[4] 吕 卉，立 宪，徐皖苏，等.定量检测慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒HBV的临床价值[J].中华肝脏病杂志，2003，11(3)：173-175.

　　[5] Lambert C, Mann S, Prange R. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins[J]. J Gen Virol，2004，85(Pt5)：1221-1225.

　　[6] 单平囡，卢志勇，宣国红，等.乙肝病毒表面抗原大蛋白与HBV复制状况的相关分析[J]. 中国卫生检验杂志，2008，18(11)：2434-2435.

　　[7] Bruns M, Miska S, Chassot S, et al. Enhancement of hepatitis B virus infection by noninfectious subviral particles [J]. J Virol，1998，72(2)：1462-1468.

　　[8] Foo NC, Ahn BY, Ma X. Cellular vacuolization and apoptosis induced by virus large surface protein [J]. Hepatology，2002，36(6)：1400-1407.