hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

　作者：李慧勇， 袁志诚， 陈 波， 陆培松， 李巧玉， 曹 侃 作者单位：(江苏大学附属人民医院神经外科, 江苏 镇江 212002)

　　【摘要】 目的： 应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体。方法： 采用分子克隆技术，从PCR2.1hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列，酶切、连接后，插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrackCMV，获得重组质粒pAdTrackCMVhVEGFA，将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy1的大肠埃希菌BJ5183，进行同源重组，获得重组子pAdeasy1hVEGFA。鉴定后,将pAdeasy1hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞)，获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAdhVEGFA)。反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒，50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度，荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果： 成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达，证明腺病毒载体rAdhVEGFA 转染成功，通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒。结论： 成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。

　　【关键词】 hVEGFA基因; 腺病毒载体; 转染; 缺血性脑血管疾病

　　[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus vector containing hVEGFA gene. Methods: The hVEGFA gene coding sequence was cloned into pAdTrackCMV plasmid to get pAdTrackCMVhVEGFA , which would be transformed into competent E.coli BJ5183 carried backbone plasmid pAdeasy1 already. The homologous recombinant adenoviral plasmid was delivered into HEK293A cells after verification. The identified recombinant adenovirus (rAdhVEGFA) was amplified in HEK293A cells. Viral particle concentration was determined by TCID50. Results: The recombinant adenovirus vector was constructed successfully. The expression of GFP was observed and the right gene was found. Conclusion: The recombinant adenoviral vector carrying hVEGFA gene was successfully constructed, and provided the basis of ischemic cerebrovascular disease′s gene therapy.

　　[Key words] hVEGFA gene; adenovirus vector; transfection; ischemic cerebrovascular disease (ICVD)

　　血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF )是Ferrara等在1989年从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化出来的一种具有肝素结合活性的生长因子,是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异性的有丝分裂原,能特异性地作用于血管内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖[1]。

　　VEGF治疗缺血性脑损伤的研究具有重要的现实意义。本实验利用重组腺病毒载体AdEasy系统构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，以为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和试剂

　　PCR2.1hVEGFA质粒由青岛海洋研究所惠赠。TaKaRa TaqTM、pMDTM 18T载体和T4 DNA连接酶(TaKaRa公司);穿梭质粒pAdtrackCMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy1、大肠埃希菌DH5α菌和BJ5183及HEK293A细胞由江苏大学医学技术研究所保存;Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ(TaKaRa公司); Pme Ⅰ、Pac Ⅰ(NEB公司)，质粒大、小量制备试剂盒(AxyPrep公司); Lipofectamin 2000(Invirogen公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 目的基因hVEGFA的克隆

　　上海生工生物技术有限公司合成引物，P1:5 ′CGCAGATCT ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG3′;P2:5 ′AAGC TCGAG TCA CCG CCT CGG CTT GTC ACA3′。以PCR2.1hVEGFA 质粒为模板行PCR，退火温度为60 ℃，PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，于长波紫外线透视仪下，切下大小为576 bp的hVEGFA的cDNA条带，胶回收hVEGFA的cDNA片段。用普通DNA聚合酶进行加碱基A尾延伸反应后，再用T4 DNA连接酶将hVEGFA cDNA与pMDTM 18T载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂在氨苄青霉素抗性 (终浓度为50 mg/ml)的LB平板上，置37 ℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取2个单克隆菌落分别接种于3 ml含氨苄青霉素抗性(终浓度为50 mg/ml) 的LB培养液中，置37 ℃恒温摇床(250 r/min)培养过夜。试剂盒提取质粒,同时送至上海生物工程公司测序分析。从上、下游两端进行核苷酸全序列分析，其结果经生物信息学分析及BLAST软件分析，以验证重组质粒的正确性。

　　1.2.2 穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA的构建

　　将pMDTM 18T载体hVEGFA用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶回收试剂盒回收576 bp的酶切产物，溶于蒸馏水备用。同时将穿梭质粒pAdTrackCMV用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶回收试剂盒回收10 kb的酶切产物，溶于蒸馏水备用。用T4DNA连接酶将以上获得的两个酶切产物进行连接反应。将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂在卡那霉素抗性(终浓度为50 mg/ml)的LB平板上37 ℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含卡那霉素抗性(终浓度为50 mg/ml)的LB培养液中，37 ℃恒温摇床(250 r/min)培养过夜。试剂盒提取质粒, Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ双酶切鉴定阳性克隆, 同时送至上海生物工程公司测序分析。

　　1.2.3 细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒

　　提取pAdTrackCMVhVEGFA质粒, 取1 μg用Pme Ⅰ线性化，37 ℃过夜。胶回收线性化的质粒并转化到含有腺病毒骨架载体pAdeasy1的BJ5183感受态细菌中, 在卡那霉素抗性的LB平板上培养16～24 h，挑选较小的菌落培养, 抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛重组体, 再用Pac Ⅰ 酶切鉴定。

　　1.2.4 重组腺病毒的包装和扩增

　　鉴定正确的重组子转化到DH5α中后大量提取质粒，Pac Ⅰ线性化pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA，乙醇、醋酸钠沉淀，用体积分数为0.75的乙醇漂洗后，重新溶解在50 μl灭菌的去离子水中。配制A液(质粒DNA 6 μg，加无血清DMEM至250 μl)和B液(14 μl Lipofectamin，加无血清DMEM稀释至250 μl)。A、B液混合，6 h后换含血清的培养液，48～72 h左右见病毒感染细胞漂起，约90%以上293A细胞出现细胞病理效应(cytopathic effect, CPE)，同时观测绿色荧光蛋白表达。收集上层细胞加1 ml无血清的DMEM，放-70 ℃/38 ℃反复冻融剧烈振荡3次，12 000 r/min离心10 min，收集上清，再用同样的方法感染293A，以扩增腺病毒数量。每培养瓶加病毒液，第1次感染用500 μl，第2次感染用50 μl，第3次感染用5 μl。制备的病毒液放于-70 ℃冻存备用。

　　1.2.5 病毒感染滴度测定

　　采用倍比稀释法在96孔板中计算病毒滴度。按下列公式计算病毒滴度TCID50=101+d(s-0.5) ，再根据公式T=a×10bTCID50/ml=a×10b-0.7PFU/ml，将TCID50/ml换算成PFU/ml。

　　1.2.6 重组腺病毒的鉴定

　　取1μl病毒上清，加入5 μl蛋白酶K，55 ℃反应1 h后水浴煮沸5 min。取1 μl所得产物，PCR扩增hVEGFA基因。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。同样处理空载体病毒Adenovirusmock。

　　2 结 果

　　2.1 目的基因hVEGFA的克隆结果

　　从PCR2.1hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列，见大小为576 bp的hVEGFA cDNA条带(图1)。M:DL2000标准参照物;V:hVEGFA图1 hVEGFA序列的克隆

　　2.2 穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA的构建和鉴定

　　用Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ双酶切重组穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA，琼脂糖凝胶电泳,结果在750 bp和500 bp之间出现特异性条带(图2),与预期相符，初步证明VEGF基因正确构建到pAdTrackCMV中，构建的重组质粒命名为pAdTrackCMVhVEGFA。将pAdTrackCMVhVEGFA交由上海生物工程公司测序分析，对外源插入片段从上、下游两端进行核苷酸全序列分析。结果经生物信息学分析及BLAST软件分析，表明hVEGFA基因序列与基因库中报告一致，表明重组穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA构建成功。M:DL2000标准参照物;Pt:pAdTrackCMVhVEGFA图2 Bgl Ⅱ/Xho Ⅰ双酶切鉴定重组腺病毒质粒

　　pAdTrackCMVhVEGFAFig 2 Identification of pAdTrackCMVhVEGFA withBgl Ⅱ and Xho Ⅰrestriction

　　2.3 细菌内同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定

　　将上述穿梭质粒转入携带腺病毒骨架pAdEasy1的BJ5183感受态细菌中，经卡那霉素抗性筛选， 用Pac Ⅰ酶切后可出现30 kb的大片段条带和4.5 kb的特征性条带(图3)，表明重组腺病毒载体pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA构建成功。图3 Pac Ⅰ酶切鉴定pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA

　　2.4 重组腺病毒的包装扩增与病毒滴度

　　重组腺病毒DNA经线性化后转染293A细胞，在包装的第2、5、8、11 天分别用倒置荧光显微镜观察，发现荧光逐渐增多，证实病毒包装成功(图4)。将得到的病毒继续感染新的293A细胞，扩增病毒(图5)。经过4轮扩增,最终病毒的滴度达到2×1010 PFU/ml。图4 转染后293A细胞绿色荧光蛋白的表达(×200)图5 重组腺病毒rAdhVEGFA的扩增(×200)

　　2.5 重组腺病毒的鉴定

　　1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，可见如图1中一样、大小为576 bp的hVEGFA的cDNA条带。

　　3 讨 论

　　缺血性脑血管疾病发病率有逐年增高趋势,死亡率高,患者即使存活,也会留有严重的后遗症。VEGF 是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异性的有丝分裂原,能诱导血管生成、增加血管通透性及维持血管功能。VEGF还有神经营养和神经保护的活性，VEGF介导的血管再生可以激发神经干细胞增殖和分化，有利于神经功能的恢复[2]。VEGF有利于缺血性脑损伤的治疗[3]，靶点给予VEGF基因可阻止局部缺血性脑损伤[4]。然而外源性的VEGF存在着反复给药、易流失、效率低及难以在移植局部维持足够浓度的缺点，如何使VEGF在局部稳定、持续、高效地表达是研究的热点。

　　重组腺病毒载体是介导基因转移和表达的重要工具之一。传统的构建腺病毒的方法有体外连接法和细胞内同源重组法。前者在体外直接将目的基因连接到腺病毒骨架质粒中,由于稀有酶切位点缺乏及大片段体外连接困难而存在技术困难[5]，后者因细胞内质粒重组效率低,需反复空斑筛选而费时费力[6]。改进的建立在大肠埃希菌内质粒间同源重组方法之上的重组腺病毒载体AdEasy 系统免去了许多细胞内的操作过程，极大地简化了实验步骤[7]。大肠埃希菌BJ5183生长迅速，质粒间同源重组效率高，且阳性克隆易于用抗生素筛选。

　　腺病毒载体由人类腺病毒血清5型经过基因工程修饰而得到，去除了病毒基因组中E1区和E3区。E1区是组装感染性病毒颗粒所必需的结构，被重新整合进包装细胞HEK293。E3区基因编码的蛋白为病毒复制非必需成分，与病毒逃避宿主的免疫有关。这些区域的缺失为在复制缺陷型重组腺病毒载体中插入外源基因提供了将近10 kb的空间。由于腺病毒载体感染靶细胞的范围广,能感染非分裂期的细胞,介导外源基因的表达效率高,且易于获得高滴度的病毒,因而较其他病毒载体具有更大优势，而且机体在初次接触腺病毒后，会产生相应的病毒抗体，从而对腺病毒介导的基因治疗产生耐受，在基因治疗的研究中被广泛应用[8]。

　　在本研究中，我们选用了腺病毒作为基因治疗的载体，其表达时间可持续数月，免疫原性越来越低，并且其本身不整合入宿主细胞的基因组中，最有希望应用于临床[9]。本实验中，由于携带目的基因hVEGFA的穿梭质粒pAdTrackCMV多克隆位点两侧及腺病毒骨架质粒pAdEasy1基因组两侧均存在相同的同源序列,在大肠埃希菌BJ5183中很快实现同源重组，经反复感染HEK293A细胞获得了高效价重组腺病毒,病毒滴度在1010～1011 PFU/ml之间。本实验为今后缺血性脑血管疾病的基因治疗研究奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1989,161(2): 851-858.

　　[2] Sun J, Sha B, Zhou WH, et al. VEGFmediated angiogenesis stimulates neural stem cell proliferation and differentiation in the premature brain [J].Biochem Biophys Res Commun, 2010,394(1): 146-152.

　　[3] Zhao Y, Li Z, Wang R, et al. Angiopoietin 1 counteracts vascular endothelial growth factorinduced bloodbrain barrier permeability and alleviates ischemic injury in the early stages of transient focal cerebral ischemia in rats [J]. Neurol Res, 2010,32(7):748-755.

　　[4] Zheng XR, Zhang SS, Yang YJ, et al. Adenoviral vectormediated transduction of VEGF improves neural functional recovery after hypoxiaischemic brain damage in neonatal rats [J]. Brain Res Bull, 2010, 81(4/5): 372-377.

　　[5] Rosenfeld MA, Siegfried W, Yoshimura K, et al. Adenovirusmediated transfer of a recombinant alpha 1antitrypsin gene to the lung epithelium in vivo [J]. Science, 1991,252(5004): 431-434.

　　[6] Mittal SK, McDermott MR, Johnson DC, et al. Monitoring foreign gene expression by a human adenovirusbased vector using the firefly luciferase gene as a reporter [J].Virus Res,1993,28(1): 67-90.

　　[7] He TC, Zhou S, Yu J, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95(5): 2509-2514.

　　[8] Benihoud K, Esselin S, Descamps D, et al. Respective roles of TNFalpha and IL6 in the immune responseelicited by adenovirusmediated gene transfer in mice [J]. Gene Ther, 2007,14(6): 533-544.

　　[9] Kamen A, Henry O. Development and optimization of an adenovirus production process [J].