白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞Bcl-2和Survivin表达的影响

　　【摘要】 目的 研究白藜芦醇(Resveratrol，Res)对人前列腺癌PC-3细胞体外生长的抑制作用和对Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响。方法 分别用不同浓度的白藜芦醇作用前列腺癌PC-3细胞24 h和48 h，MTT法分别测定细胞抑制率，免疫组化SP法分析100 μmol/L 浓度白藜芦醇作用48 h时 PC-3细胞Bcl-2和Survivin蛋白的表达。结果 不同浓度白藜芦醇作用24 h与48 h时PC-3细胞生长明显受到抑制(P<0.01);Bcl-2和Survivin蛋白免疫组化染色明显减弱(P<0.01)。结论 白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞体外生长有明显的抑制作用，其机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达，增加前列腺癌PC-3细胞凋亡有关。

　　【关键词】 白藜芦醇,前列腺癌,细胞凋亡,Bcl-2,Survivin

　　Effect of Resveratrol on Expression of Bcl-2 and Survivin

　　in Human Prostate Cancer Cells in vitro

　　Xia Zhiping, Zheng Hang, Peng Wei

　　Department of Urology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071

　　【Abstract】Objective To study the inhibitive effect of Resveratrol (Res) on the proliferation of human prostate cancer cells in vitro and the effect of Resveratrol on Expression of Bcl-2 and Survivin.Methods The cell proliferation was tested by MTT method after induction by Res for 24h and 48h. Bcl-2 and Survivin were examined by SP immunohistochemistry.Results Res showed a significantly inhibitive effect on PC-3 cells in the two groups (P<0.01), and weakened color of Bcl-2 and Survivin protein stained by SP immunohistochemistry (P<0.01).Conclusion This study indicated that Res had significantly inhibitory effect on the PC-3 cells in vitro. The likely mechanism of inhibitive function is correlated with cancer cell apoptosis caused by down-regulating Bcl-2 and Survivin protein expression.

　　【Key words】resveratrol; prostatic neoplasms; apoptosis; Bcl-2; Survivin

　　白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类二苯乙烯多酚化合物，母核结构与己烯雌酚相似，分子式为C14H12O3，分子量为228.24，其广泛存在于葡萄、虎杖等60余种植物中。近年来，其雌激素样活性和抗肿瘤活性成为研究的热点。本研究初步探讨了白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞体外生长抑制作用及对凋亡抑制蛋白Bcl-2和Survivin表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品和试剂 Res购自Sigma-Aldrich公司(批号38K5202)，纯度为99%;RPMI1640培养液与胰酶购自Gibco公司;新生小牛血清购自Hyclone公司;二甲基亚砜(DMSO)购自Amersco公司;免疫组化试剂购自北京博奥森生物技术有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 人前列腺癌细胞株(PC-3)细胞引自武汉大学典型生物保藏中心，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液在5% CO2的37℃培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。实验用细胞为对数生长期细胞，经台盼兰染色检查，活性在98%以上。

　　1.2.2 MTT检测细胞抑制率[1] PC-3细胞经胰酶消化后以1×105/ml浓度接种于96孔培养板，37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养24 h后，换含Res浓度分别为0 μmol/L(对照组)，25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L(实验组)的RPMI1640培养液180 μl(Res用DMSO溶解，DMSO在培养液中浓度<0.1%)继续培养24 h时和48 h时每孔加MTT液(5 g/L)20 μl，相同条件下继续培养4 h后终止培养。吸弃上清液加入DMSO 150 μl，震荡10 min，结晶充分溶解后，利用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光值A490。每组4个复孔，另设只加培养液不加细胞和Res的空白组(调零用)。实验重复2次。按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率IR=1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

　　1.2.3 免疫组化SP法测定Bcl-2和Survivin蛋白的表达[1]

　　1)细胞爬片的制作。普通盖玻片，常规清洗、泡酸、高压、烘干后置于6孔板内。PC-3细胞经胰酶消化后，调整浓度约为1×105/ml，将细胞悬液滴入铺有盖玻片的6孔板，每孔约1 ml，于温箱中培养。每天用倒置显微镜观察细胞的生长情况，细胞覆盖盖玻片约80%～90%时(约3～4 d)，换含100 μmol/L的Res的培养液(实验组)继续培养2 d。对照组不加Res。

　　2)免疫染色。培养2 d后，将盖玻片取出，用中性树胶将盖玻片无细胞面粘贴于洁净的载玻片上。PBS清洗标本3次(每次1 min)后冰丙酮(-20oC)固定15 min，空气干燥5 min。PBS清洗标本3次(每次2 min)后0.5%Triton X-100孵育20 min。之后按照免疫组化SP试剂盒说明书操作完成实验。同时设立不加一抗的阴性对照组。显微镜下观察并拍照，胞浆被染成黄色即为阳性染色。分别取12张对照组照片和13张实验组照片利用Image-Pro Plus 6.0作平均光密度分析。

　　1.3 统计学处理 数据以±s表示，用SPSS 13.0统计软件分析处理，组间显著性检验采用方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Res对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响 随Res浓度增高，作用时间延长，PC-3细胞生长抑制率增加，见表1。Res对前列腺癌PC-3细胞的抑制作用呈现出时间-剂量依赖性。见图1。表1 Res对前列腺癌PC-3细胞生长的影响

　　2.2 Res对前列腺癌PC-3细胞中Bcl-2、Survivin蛋白表达的影响 对照组胞浆Bcl-2、Survivin蛋白表达均为强阳性，被染成深黄色;实验组胞浆Bcl-2、Survivin蛋白表达均为弱阳性，被染成淡黄色;未加一抗的阴性对照组胞浆无染色。见封四图2。实验组和对照组平均光密度比较见表2。表2 100 μmol/L Res作用PC-3细胞48 h后Bcl-2及Survivin蛋白表达的变化

　　3 讨论

　　Morton等[2]研究显示前列腺组织中含有植物雌激素，而且在那些较低前列腺癌风险人群中植物雌激素值较高。据此，有人提出植物雌激素可能具有抑制前列腺癌细胞生长的作用。于是，世界各地的学者沿着这一思路，对植物雌激素对前列腺癌的抑制作用进行了大量的研究[3，4]。大量的流行病学及体内外实验的结果表明，植物雌激素对激素相关性疾病，尤其是前列腺癌、乳腺癌、骨质疏松症、更年期综合征、心血管疾病等，均具有潜在的预防和治疗作用[5]。白黎芦醇属植物雌激素，母核结构与己烯雌酚相似，有一定的雌激素活性[6，7]。

　　Bcl-2是目前最受关注且被第一个确认能对抗细胞凋亡的基因[8]。其家族成员包括两类：Bcl-2类，是凋亡抑制因子，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等;Bax类，为凋亡促进因子，包括Bax、Bak、Box。Bcl-2通过调节线粒体的功能来调节细胞的凋亡。Survivin是近来发现的人类凋亡抑制蛋白家族成员之一，主要通过抑制凋亡酶的作用来阻碍细胞凋亡，它具有抑制细胞凋亡和调节细胞周期和细胞分裂的双重功能，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远大于Bcl-2家族成员[9]。Survivin主要分布于胎盘及分化未成熟组织，在成人正常细胞中几乎不存在。已发现人类各种肿瘤组织细胞中Survivin含量丰富，它在癌细胞中过度表达可能是肿瘤预后不良的一个因素。

　　本研究结果显示，25 μmol/L白藜芦醇作用24 h时即对前列腺癌细胞体外生长表现出抑制作用，浓度大于50 μmol/L抑制作用明显，表现出一定的时间、剂量依赖性。在免疫组化实验中，癌细胞Bcl-2与Survivin染色明显减弱，表明这种抑制作用可能与Bcl-2和Survivin表达下调有关，从而诱导PC-3细胞凋亡。随着对白藜芦醇的进一步研究和开发，其有望成为临床治疗前列腺癌的新型植物药。

　　【参考文献】

　　1 马泳泳，黄进.白藜芦醇诱导K562/AO2 凋亡与mdr1基因表达的关系[J].现代中西医结合杂志,2008,17(4):487489.

　　2 Morton.Biological Effects of Resveratrol[J]. Life Sci,2000,66(8):663673.

　　3 Weber K S, Setchell K D,Stocco D M, et al.Dietary soyphytoestrogens decrease testosterone levels and prostate weight without altering LH , prostate 5 alpha-reductase or testicular steroidogenic acute regulatory peptide levels in adult male Sprague-Dawley rats[J].J Endocrinol,2001,170(3):591599.

　　4 Lamartiniere C A,Cotroneo M S, Fritz W A, et al.Genistein chemoprevention: timing and mechanisms of action in murine mamnlary and prostate[J].J Nutr,2002,132(35):552558.

　　5 杜凤英,詹平.植物雌激素抗癌作用的研究进展[J].预防医学情报杂志, 2005,21(2):153154.

　　6 吕秋军,吴祖泽.白黎芦醇的雌激素活性及其分子机制研究进展[J].中国药学杂志,2003,38(9):651653.

　　7 FremontL.Biological effects of resveratrol[J].Life Sci,2000,66(8):663.

　　8 Rafi M M, Vastano B C, Zhu N, et al.Novel polyphenol molecule isolated from licorice root(Glycrrhiza glabra) induces apoptosis,G2/M cell cycle arrest,and Bcl-2 phosphorylation in tumor cell lines[J].Agric Food Chem,2002, 50(4):677684.

　　9 都昌胡,徐军.凋亡蛋白抑制剂家族研究进展. 世界华人消化杂志,2005,13:15811589.